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猪传染性胃肠炎（TGE）和猪流行性腹泻（PED）均是由冠状病毒引起的以仔猪呕吐、腹泻和脱水为特征的两种传染病。目前，TGE和PED的诊断方法主要有病毒中和试验、免疫荧光法、免疫电镜法、ELISA和RT-PCR法等。随着分子生物学技术的不断发展，ELISA和RT-PCR法以其敏感性高、特异性强越来越受到人们的重视。 本研究所用TGEV和PEDV可在PK15细胞中大量增殖。在PK15细胞上分别培养TGEV和PEDV，待70％细胞出现CPE时收毒。应用Reed-Muench法测得TGEV和PEDV的TCID50。结果为：TGEV的TCID50为10-4.8／0.1mL。查反对数得63095，即该TGEV液63095倍稀释液0.1 mL等于1个TCID50。PEDV的TCID50为10-4.2／0.1mL。查反对数得15849，即该PEDV液15849倍稀释液0.1 mL等于1个TCID50。 又在Genbank中查出猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）的基因组序列，结合两种病毒基因组结构特点，在对两种病毒基因序列进行同源性比较的基础上，选择二者的S蛋白基因为引物设计区。根据多重PCR引物设计原则，应用Primer5.0软件设计了TGEV和PEDV各两条引物。其中，TGEV的引物可扩增出426bp的特异片段，PEDV的引物可扩增出584bp的特异片段。经过引物浓度和MgCl2浓度滴定、退火温度确定等PCR反应条件的优化，确定TGEV和PEDV单项RT-PCR体系的最佳条件分别为，引物浓度：TGEV 0.8-1.6μmol／L、PEDV 0.4μmol／L；MgCl2浓度：TGEV为2mmol／L，PEDV为2mmol／L；退火温度：TGEV为54℃，PEDV为52℃-54℃。经敏感性试验确定，TGEV RT-PCR可检测0.63 TCID50的模板，PEDV RT-PCR可检测1.6 TCID50的模板。 在此基础上，经PCR反应条件的优化，建立了TGEV和PEDV的二联RT-PCR，其最佳系统组成为，引物浓度：TGEV为0.6μmol／L，PEDV为0.4μmol／L；MgCl2浓度为2mmol／L，dNTP浓度为100μmol／L。最佳循环条件为：94℃1min→56℃50s→72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。 本试验建立的TGEV和PEDV的二联RT-PCR可在同一反应中，同时扩增出这两种病毒不同大小的两个特异性核苷酸片段，以建立的二联RT-PCR扩增其它对照病毒未见阳性反应。并确定该二联RT-PCR可检测TGEV6.3TCID50的模板，PEDV15.8TCID50的模板，比单项RT-PCR的敏感性分别下降了一个数量级。用建立的二联RT-PCR方法对50份临床采集病料进行检测，检出TGEV8份，PEDV3份。TGEV占被检病料的16％，PEDV占被检病料的6％。同时，所检病料中发现1份TGEV和PEDV混合感染，证实在临床病例中有TGEV和PEDV的混合感染存在。吉林农业大学硕士学位论文TGEV和PEDV二联RT一PCR方法的建立及初步应用 初步应用证明，该二联RT一PCR具有良好的敏感性和特异性。本研究为这两种疾病的临床诊断提供进一步可借鉴的方法，具有着潜在的应用价值。