研究背景在2012年CDC (Centersfor Disease Control)肿瘤统计数据中,乳腺癌的发病率,已成为仅次于肺癌的第二位,并且在死亡率中排第五位。而在女性人群中,乳腺癌是患病率以及死亡率均最高的恶性肿瘤。而远处转移发生,包括肺、骨骼及脑内转移,成为乳腺癌患者致死的主要原因。上皮间质转化(EMT)是指上皮细胞在一些因素的作用下,失去极性及细胞间紧密连接和黏附连接,获得了浸润性和游走迁移能力,变成具备间质细胞形态和特性的细胞的过程,不仅在胚胎发育中起到了重要作用,现在的理论认为,EMT过程在肿瘤的发生发展中,尤其是远处转移的过程中,起到了重要的作用。因此,深入的研究了解EMT过程,可更进一步的了解乳腺癌发生发展的模式,为乳腺癌治疗及减少远处转移的发生提供一种可行思路。而目前的关于EMT过程在肿瘤内的作用都是来源于肿瘤细胞系的培养或是离体肿瘤切片的分子生物学检测,缺乏直接的活体研究数据,对于认识EMT过程的活体特征仍然十分欠缺。基于以上的研究背景,本课题拟采用EMT驱动的荧光蛋白转变转基因小鼠乳腺癌模型,结合双光子显微镜活体成像,同时探索离体肿瘤及活体原位乳腺癌内EMT过程相关的肿瘤细胞形态学及功能学变化,同时,利用此模型及成像方法,探索抗肿瘤药物对EMT过程影响的活体特点,为EMT过程在原位乳腺癌内的存在以及活体细胞学特征提供直接的影像学证据,并为抗肿瘤药物对EMT过程的影响提供直接的影像学监测方法,为进一步乳腺癌治疗的研究提供新的思路。研究方法第一部分 EMT介导的荧光转变指示乳腺癌小鼠模型的构建及鉴定本课题采用EMT驱动的荧光蛋白转变转基因小鼠乳腺癌模型,小鼠体内携带MMTV-PyMT、Fsp1-Cre以及Rosa26Loxp-RFP-GFP报告基因,获取转基因小鼠自发原位乳腺癌,消化获得原代乳腺癌细胞,经流式细胞仪筛选,获得纯RFP阳性肿瘤细胞。经细胞培养基免疫细胞染色,验证RFP-GFP荧光蛋白转变与细胞上皮-间质表型变化之间的关系,验证转基因小鼠乳腺癌模型的可行性。将筛选的RFP阳性肿瘤细胞种植于SCID小鼠乳腺脂肪垫内,形成原位乳腺癌,利用在体皮瓣成形术暴露原位肿瘤,进行双光子显微镜成像,来验证双光子纤维性活体乳腺癌模型成像的可行性。第二部分离体细胞EMT过程的影像学特征及小鼠原位乳腺癌内EMT过程活体细胞学特性研究利用筛选的纯RFP阳性细胞,经完全培养基培养,并利用细胞连续成像设备进行动态成像,观测离体细胞EMT过程发生过程中细胞信号及形态学变化,来呈现离体肿瘤细胞EMT发生的过程。利用双光子显微镜小鼠原位乳腺癌活体成像,经同视野连续动态成像,获取在体原位肿瘤内EMT过程发生过程中细胞信号及形态学变化,获取活体肿瘤内EMT过程发生过程的影像学资料。分析活体成像所获得的EMT后GFP阳性细胞的与细胞侵袭转移相关的细胞形态学特征及运动学数据,并利用肿瘤切片的全切片成像,分析EMT发生在肿瘤内的分布特征,综合分析EMT后肿瘤细胞对肿瘤生长及侵袭迁移所起的作用。第三部分抗肿瘤药物对原位乳腺癌内EMT过程影响的活体影像学研究经乳腺癌患者肿瘤基因数据库的筛选,选定c-Met靶向药物卡博替尼(Cabozantinib,XL-184)作为抗肿瘤药物,首先在离体筛选的肿瘤细胞内验证药物对体外TGF-β所诱导的EMT过程的影响。经药物处理的小鼠,首先观察药物对原位乳腺癌生长速度的影响,药物处理后,经双光子显微镜原位肿瘤活体成像,观察肿瘤内GFP阳性细胞的分布特点、细胞学形态特点,与对照组比较,分析药物处理对原位肿瘤内EMT过程的影响,并利用肿瘤切片免疫染色验证其细胞表型变化。研究结果1.经过原代分离的肿瘤细胞,经过筛选、培养,并利用上皮表型表面标志物E-cadherin进行免疫染色,结果证实当肿瘤细胞由RFP阳性转变为GFP阳性时,肿瘤细胞发生了 EMT过程,失去了上皮细胞表型标志物,向间质细胞表型转变,证实了此转基因小鼠肿瘤模型可用荧光蛋白颜色的转变来标识EMT过程的发生。在种植的小鼠原位乳腺癌活体双光子显微镜成像中,原位肿瘤内可见GFP阳性细胞的散在分布,证实双光子显微镜可用于原位肿瘤内EMT过程的活体成像。2.经培养细胞连续动态成像,获得了肿瘤细胞由原先无GFP表达至GFP强阳性表达的过程,并且在此过程中,肿瘤细胞形态逐渐向长梭形发生改变,并且类似的过程在原位乳腺癌活体成像中也被获取到,即离体及在体肿瘤内EMT过程的影像学变化被成功获取。3. EMT后肿瘤细胞形态学分析结果表示,肿瘤细胞发生EMT后,绝大部分细胞(96.55%)变为具有迁移侵袭表征的细胞学形态,而仅有少部分(3.45%)细胞变为肿瘤相关成纤维细胞参与肿瘤生长发展的调节。并且经EMT,肿瘤细胞获得了更多的侵袭相关形态学特征,呈长梭形、具有更多细胞膜突起,在肿瘤小叶内移动较缓慢,而在血管间隙边缘时移动加速,且血管间隙边缘细胞移动呈簇状,形成"cell streaming"。4.在离体肿瘤细胞培养下,药物XL-184逆转了 TGF-β所诱导的EMT过程,而在活体原位乳腺癌中,XL-184抑制了肿瘤的生长,活体双光子显微镜成像可见肿瘤内呈簇状分布的GFP阳性细胞,细胞形态类似于周边RFP阳性上皮表型细胞,经免疫染色证实簇状GFP阳性细胞表达E-cadherin,为上皮表型细胞。结论EMT驱动的荧光蛋白转变转基因小鼠乳腺癌模型结合双光子显微镜活体成像,成功地进行了原位乳腺癌内EMT过程的活体成像,并且获得了离体细胞及活体原位乳腺癌内细胞水平EMT过程的直接影像学证据。经过细胞形态学分析,可见EMT过程后,肿瘤细胞主要表现为具有迁移侵袭表征的细胞学形态,证实了 EMT在肿瘤侵袭转移过程中起重要作用的理论。离体肿瘤细胞药物处理,证实了抗肿瘤药物可抑制EMT过程,而活体成像数据证实,抗肿瘤药物可在EMT过程发生的早期终止逆转EMT的发生,因此药物抑制乳腺癌的生长及转移部分是通过抑制EMT过程实现的,为乳腺癌的治疗提供了新的靶点。