第一部分 中药牛蒡子木脂素类似物的合成及抗肿瘤活性检测研究背景:中药牛蒡子富含木脂素类成分,该类成分是牛蒡子的主要活性成分。牛蒡子木脂素成分的结构和药理活性多样,具有重要的研究意义。但这类木脂素化合物在提取、分离以及纯化方面存在操作步骤繁琐、分离效率低等问题,使得其纯品的大量制备和体内药理作用的深入研究成为难题。研究目标:本文旨在研究牛蒡子生物活性木脂素化合物以及其类似物的合成,探究一些新的合成方法,对文献报道的牛蒡子木脂素合成路线进行如下优化:简化合成步骤、提升合成效率、降低合成难度,使用更加廉价、易得、安全的合成试剂等。为研究开发抗氧化、抗衰老、抗癌等新型木脂素类小分子药物提供稳定可行的合成技术,并且为新药开发奠定先导物质基础以及思路。同时,对合成的木脂素类化合物进行抗肿瘤活性探讨。研究方法:采用有机化学合成的手段,结合前人对于牛蒡子中各个木脂素成分的生物活性以及其单体结构研究分析,通过多步化学反应,以及萃取、正相硅胶柱、反相硅胶柱、高效液相(HPLC)色谱分离等分离手段对合成产物进行分离,并采用波谱分析技术(1H-NMR、13C-NMR等)以及MS分析方法,合成了一系列牛蒡子内含有的木脂素单体,并且对合成的单体化合物进行结构鉴定和细胞水平的抗肿瘤活性检测。1、拉帕酚A的合成是通过以下三步方法合成的:首先是运用三溴化硼的选择性脱甲基反应,使得牛蒡子苷元还原生成重要中间体罗汉松树脂酚。然后使用氢化铝锂将阿魏酸乙酯还原成松柏醇。最后,合成的罗汉松树脂酚和松柏醇在三氯化铁或双氧水与辣根过氧化物酶催化的自由基偶连反应下生成拉帕酚A。2、在尝试使用全合成方法制备罗汉松树脂酚时,以香草醛为原料,采用汇聚法,通过酸或碱催化的酯化反应、成醚反应等构建罗汉松树脂酚骨架。采用还原反应和酯化反应构建罗汉松树脂酚的内酯五元环。但是在最后一步采用钯碳加氢脱去保护苄基以及还原两个双键时,经TLC以及抽滤、过正向硅胶柱、HPLC等分析、纯化后,得到两个化合物单体。并通过采用波谱分析技术(1H-NMR、13C-NMR等)以及MS分析方法对其结构进行分析,阐明了还原顺序。3、受罗汉松树脂酚全合成路线启发,发现汇聚法生成的产物与牛蒡子中含有的木脂素类成分——开环异落叶松树脂酚结构类似,于是采用钯碳加氢法该产物进行还原,得到开环异落叶松树脂酚。4、采用SRB法测定合成化合物对宫颈癌Hela细胞增殖的影响。研究结果:本文章报道了在牛蒡子中分离得到的一系列木脂素的合成方法,在实验探索过程中,我们不仅首次合成了已知化合物拉帕酚A,通过全新的路线、以及合成方法并得到了已知或全新的化合物,并通过细胞实验研究各合成产物的生物活性。1、首次合成了牛蒡子内一个木质素类的有效抗过敏成分——拉帕酚A。2、首次通过牛蒡子苷元为原料合成罗汉松树脂酚。3、在尝试以香草醛为原料全合成罗汉松树脂酚时,得到两个全新的罗汉松树脂酚的衍生物。4、采用一种全新、操作简便、原料易得的路线合成牛蒡子内一个木质素类成分——开环异落叶松树脂酚,为合成开环异落叶松树脂酚提供一条更加高效、操作简便的合成方法。5、经体外抗肿瘤活性检测,测得新方法合成的化合物拉帕酚A、以及中间体2-(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)-4-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-methylbutanoic acid对宫颈癌HeLa细胞的半数抑制浓度IC50分别为48 μM和大于100μM(作为对照的天然拉帕酚F的IC50为28 μM)。结论:首次报道了天然牛蒡子木脂素——拉帕酚A的合成方法。通过化学合成的方法,可以大大降低拉帕酚A的制备难度,并且为拉帕酚A的大量制备提供合成参考。对结构类似的药物研发提供了新思路。将牛蒡子苷元为原料合成罗汉松树脂酚,使得两个同时存在于牛蒡子中的木脂素得到转化。并且通过全合成的方法,合成得到两个全新的罗汉松树脂酚的衍生物。通过更加简便的方法合成开环异落叶松树脂酚,并通过不同的还原方法合成开环异落叶松树脂酚衍生物。解决了前人在合成开环异落叶松树脂酚路线长或者操作复杂、使用试剂危险或者反应温度难以达到的问题。在体外抗肿瘤活实验结果表明:拉帕酚A和拉帕酚F均显出了对HeLa细胞增殖的抑制作用。第二部分二氢焚光索探针的制备及用于氣化应激检测研究背景:由于小分子荧光团可用于生物分析并且具有独特的优越性,其设计和合成一直以来都是学术界和工业界关注的热点。荧光素探针己运用于pH指示、金属离子检测、细胞氧化还原传感、酶活性监测、以及诊断学等诸多方面。目前,二氯二氢荧光素(DCFH)的传统制备方法都存在着一个或多个缺点,例如需要昂贵且还原性强的还原剂,苛刻的反应条件以及有时需要额外的步骤来处理用过的含金属的试剂等。开发温和、简捷且可控的还原方法,将荧光素还原成二氢荧光素酸或二氢荧光素醇,十分有必要。研究目标:结合之前对二氢荧光素酸或二氢荧光素醇还原方法上的不足,旨在开发一种温和且可控的还原方法,将荧光素还原成二氢荧光素酸或二氢荧光素醇。并且应用该方法还原多种咕吨类荧光素,研宄出全新还原方法的适用范围。测试二氢荧光素酸和二氢焚光素醇评估其对于活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)不同的反应性。并且在该还原方法的基础上,结合运用所需官能团修饰咕吨类荧光团核心结构,开发出具有双重功能的荧光探针。研究方法:本论文采用有机化学合成的方法,系统地研宄了以荧光素为模型底物,使用NaBH4/I2为还原条件,通过调节反应条件:例如NaBH4/I2还原剂的使用量,反应时间和温度,使用高效液相(AgilentHPLC 1260,USA)分析所有测试的反应产物的峰面积积分,来确定所有测试的反应的产率。并确立了一种高效、温和且高度可控的还原方法。在该方法的基础上,还原了包括荧光素、二氯荧光素、罗丹明B等咕吨类荧光团染料,并做了一系列测试。在测试中,我们选择了用于生成反应性自由基物质的标准反应体系:hrp/h2o2体系,用于评估R0S探针的反应性。并且在最优的还原条件下,合成了两种细胞器靶向探针,并且通过细胞成像实验,验证细胞器靶向探针对活细胞中的氧化应激进行亚细胞成像能力。研究成果:设计了温和的NaBH4/12还原体系,可以轻松地将荧光素还原为二氢荧光素醇和二氢荧光素酸。使用HRP/H202体系作为产生反应性自由基物质的模型系统,与二氢荧光素酸形式相比,二氢荧光素醇对氧化应激感测具有更强的反应性。最后,使用我们优化的还原方法合成了两个双重功能探针,探针显示了亚细胞氧化应激荧光成像的巨大潜力。研究结论:通过调节NaBHWh还原体系使用量、反应温度以及反应时间,可高效、温和且高度可控地将将荧光素还原为二氢荧光素醇和二氢荧光素酸,并且该方法同样适用于多种咕吨类焚光团。合成的两个双重功能探针,这些探针显示了亚细胞氧化应激荧光成像的巨大潜力。