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细胞先天性免疫的第一道防线是那些能识别病源菌保守成分的受体。研究发现草鱼感染嗜水气单胞菌引发细菌性败血症。在感染转录组数据中发现TLR受体(Toll-like receptor)基因是差异表达基因,这说明TLR基因家族参与机体抵御外源性致病菌的入侵。另外组织表达谱结果显示,大部分TLR基因在免疫组织中高表达,比如皮肤、脾脏、肝和鳃等。从转录组水平和组织表达模式都说明TLR参与与机体免疫反应,因此对TLR基因全面、系统化的研究尤为重要。本文基于草鱼基因组、嗜水气单胞菌感染脾脏转录组、以及嗜水气单胞菌抗病组和易感组转录组数据深度剖析TLR基因具体信息,对已完成TLR18,TLR20和TLR21cDNA克隆的基础上进行功能性探究。主要结果如下:草鱼基因组有20种TLR基因,分属于6个亚家族,基因组中尚未发现TLR14,TLR16,TLR19和TLR26基因,却发现草鱼特有的TLR27基因。系统发育和共线性分析显示TLR11亚家族是最大的分支,TLR11家族基因共线性分析结果和洞穴鱼、斑马鱼、河豚和罗非鱼相似。TLR基因组序列分析,大部分TLR基因没有内含子,属于一个亚分支上的TLR基因一般有相似的内含子/外显子结构和数目。正常组织表达谱表明TLR5b,TLR5a,TLR1和TLR25表达量相对比较高,但总体TLR基因RPKM比较低,约为144.73。草鱼嗜水气单胞菌易感和抗病转录组中有9个TLR基因差异表达;脾脏转录组中6个TLR基因上调,上调或抑制的程度为2到12.9倍。其中TLR20.2上调最为显著,在感染48h时,该基因上调了12.9倍。体外gctlr18诱导表达,利用鞭毛蛋白,LPS和poly(I:C)分别刺激CIK细胞系,发现gctlr18的表达量均呈现先上升后下降的趋势,分别在24h,48h和12h表达量到达峰值,诱导倍数分别是9.78倍,8.87倍和8.92倍。过表达gctlr18基因对il-8,inf-1和tnf-α有调控作用,分别上升1.2倍,10.15倍和3.61倍,其中对il-8没有显著诱导性。过表达gctlr18能激活NF-κB荧光报告系统,以及抵御细菌入侵的作用,细菌侵染数比对照组少83.4%。因此,gctlr18可能识别鞭毛蛋白,LPS和poly(I:C)致病成分,gctlr18过表达能诱导炎症因子分泌,可能是通过NF-κB信号通路引发炎症以清除外源性病原菌。将TLR20 cDNA序列根据草鱼基因组数据库比对得到该基因属于gctlr20.2,感染嗜水气单胞菌草鱼脾脏转录组中属于差异表达基因。体外刺激实验表明,鞭毛蛋白,LPS和poly(I:C)能刺激诱导gctlr20.2的表达,鞭毛蛋白和poly(I:C)在24h达到峰值3.35倍和2.8倍,LPS刺激后6h时表达量最高2.07倍。过表达和干扰该基因对下游免疫相关基因有调控作用,gctlr20.2过表达诱导il1β,il8和tnf-α转录增加,il1β上调1.46倍,il8上调1.45倍,tnf-α上调1.91倍。siRNA-tlr20.2对gctlr20.2mRNA有65.7%的抑制效率,并且下调ifn和il8基因的转录,分别为0.77倍和0.14倍。因此,gctlr20.2也能识别鞭毛蛋白,LPS和poly(I:C)致病成分,gctlr20.2过表达激活NF-κB信号通路引发炎症反应。下调gctlr20.2能够减少炎症因子分泌,有助于机体恢复免疫平衡。鞭毛蛋白和LPS体外刺激gctlr21表达,同时过表达和干扰该基因对下游免疫相关基因有调控作用。LPS感染6h时,表达量上升到2.45倍,到24h到达峰值8.63倍,随后缓慢下降。FLA-ST感染6h时,转录水平上升至2.7倍,24h时出现峰值5.61倍,48h后下降到2.22倍。Gctlr21过表达诱导il1β和ifn表达显著性上调,分别为2.12倍和1.66倍,并且激活NF-κB荧光报告系统。Sitlr21-2对gctlr21表达抑制效果为0.48倍,并显著性抑制下游免疫因子il1β,il8和tnf-α的表达,对ifn抑制效果不明显。筛选靶调控microRNA,发现Ci-miR-3,let-7i和Ci-miR-14对gctlr21基因转录有抑制作用。过表达microRNA对免疫相关基因也有调控作用。因此,gctlr21基因可能也参与鞭毛蛋白和LPS的识别过程,推测gctlr21过表达能激活NF-κB调控炎症因子的转录。RNA干扰的效果与Ci-mi R-3,let-7i和Ci-miR-14也可以靶调控gctlr21的表达效果类似,推测gctlr21转录下调能减弱炎症反应避免机体过度损伤。