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研究背景宫颈癌是全世界范围内常见的女性恶性肿瘤。持续感染高危型人乳头瘤病毒(HPV)是发生宫颈癌的明确危险因素。HPV18是最常见的高危型HPV之一。HPV编码的E6和E7早期癌蛋白的检测具有重要的生物学意义。然而目前尚无商业化、可应用于临床检测的HPV18 E7抗体。另外,女性感染HPV的亚型分布在宫颈癌筛查、治疗、随访及HPV疫苗研发等工作中均具有指导意义。目前关于浙江杭州地区宫颈病变患者HPV各亚型的感染情况尚无系统的研究报道。目的本课题目的在于制备HPV18 E7多克隆抗体,并以该抗体用免疫组化法检测HPV18 E7蛋白在宫颈病变组织中的表达,评估该抗体的临床应用价值。同时本课题调查2018年就诊于浙江大学医学院附属邵逸夫医院的宫颈癌和宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的HPV感染亚型分布情况。方法原核表达HPV18 E7蛋白后免疫新西兰兔获得HPV18 E7多克隆抗体Ig G,Western Blot检测特异性后,收集我院经PCR法检测HPV18 DNA阳性的宫颈癌和CIN组织,以该抗体为一抗,应用免疫组化法检测宫颈病变组织中HPV18 E7蛋白的表达。同时本研究收集2018年就诊于我院的宫颈癌和CIN患者的病例资料,排除不符合标准者,分析不同级别宫颈病变患者年龄特点、HPV感染率和各亚型的分布差异。结果一、HPV18 E7多克隆抗体制备、鉴定及免疫组化法检测宫颈病变中HPV18 E7蛋白将pGEX–4T–2/HPV18 E7原核表达载体转化的感受态细胞E.coli DH5α以0.2mmol/L IPTG于26℃下诱导3h,超声裂解、纯化酶切后,经12%SDS-PAGE鉴定获得大量可溶性HPV18 E7蛋白。用HPV18 E7抗原免疫新西兰兔,分离血清获得多克隆抗体Ig G。Western Blot提示该抗体可特异性识别Hela细胞内的HPV18 E7蛋白。免疫组化成功检测到CIN和宫颈癌组织中HPV18 E7蛋白在细胞核的表达,且宫颈癌组织的染色强度高于CIN组织。HPV18 DNA阳性的宫颈癌组织中HPV18E7蛋白表达阳性率高达93.8%(15/16)。二、宫颈癌和CIN患者的HPV亚型分布研究共收集2018年我院符合标准的病例755例,其中CIN1组287例,CIN2组183例,CIN3组195例,宫颈癌组90例。平均年龄为41.49±10.52岁,各组的平均年龄随着宫颈级别的升高而增大。CIN1的发病高峰为30-34岁,宫颈癌的发病高峰为45-49岁,宫颈癌的年龄高峰比CIN1迟15年。45-54岁的宫颈癌患者数占所有宫颈癌患者数的62.3%。CIN和宫颈癌病例感染率最高的前5种HPV亚型依次为HPV16(288例,38.15%)、HPV52(173例,22.91%)、HPV58(134例,17.75%)、HPV18(55例,7.28%)和HPV33(53例,7.02%)。HPV单一感染宫颈癌组中HPV16阳性占比高达62.5%,远高于CIN1组。结论1、本课题成功表达可溶性HPV18 E7蛋白,且作为抗原免疫新西兰兔获得了HPV18 E7多克隆抗体Ig G。2、经Western Blot和免疫组化鉴定,HPV18 E7多克隆抗体Ig G能特异识别细胞和宫颈病变组织中的HPV18 E7蛋白,有望成为临床诊疗中检测HPV和评估宫颈肿瘤性疾病宫颈病变程度的辅助手段。3、本研究发现宫颈癌的高发年龄为45-54岁,呈现年轻化特点。4、本研究中宫颈癌患者和CIN感染HPV亚型的前5位依次为HPV16、HPV52、HPV58、HPV18和HPV33,与其他地区不同。HPV52、HPV58在宫颈病变中的作用不容忽视。