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骨肉瘤是骨的原发恶性肿瘤，约占20岁以下人群恶性骨肿瘤总数的60％，其恶性程度高并极易复发和转移，发病原因尚不清楚。目前对骨肉瘤的治疗通常采用手术结合新辅助化疗的方法，但由于肿瘤耐药、转移等原因使治疗结果并不能令人满意，骨肉瘤患者的生存率已进入了平台期，如何进一步提高骨肉瘤的疗效并在根本上对其进行治疗是亟待解决的问题。细胞周期调控异常与肿瘤发生密切相关，各种致瘤因素最终导致细胞周期紊乱，增殖异常而诱发肿瘤，故肿瘤本质上是一种细胞周期病。在骨肉瘤中同样也存在着细胞周期的调节失控。周期蛋白依赖激酶（Cdks）的时相性激活是细胞周期调控机制的核心，它通过对相应的底物磷酸化，驱使着细胞完成细胞周期，而周期蛋白（cyclins）是调控Cdks活性的最基本成分，周期蛋白表达量及活性的波动直接决定着Cdks的活性状态。作为Cdk1及Cdk2的调节亚基，周期蛋白A2（cyclinA2）起始并控制着DNA的复制，对细胞DNA合成期（S期）、有丝分裂期（M期）的进程以及G1／S期、G2／M期的转换至关重要。有证据表明cyclinA2具有癌基因活性，其反常增多与细胞的恶性转化密切相关。同时cyclinA2也是多种癌基因促使细胞恶性转化进程中的关键靶点，如致癌基因c-Fos可通过cyclinA2的失控表达使成骨细胞恶性转化并发展为骨肉瘤。目前在多种癌变组织包括骨肉瘤中发现cyclinA2蛋白的高表达或过表达，而在正常组织细胞中低表达或不表达。临床研究显示cyclinA2高表达与骨肉瘤的不良预后密切相关。这些证据均提示抑制或消除cyclinA2在骨肉瘤细胞中的表达有可能成为骨肉瘤治疗的一个有效策略。RNA干扰（RNAi）是广泛存在于真核生物中的特定基因转录后沉默机制，其作用机理是通过细胞内的核酸内切酶Dicer将进入细胞的长双链RNA（dsRNA）剪切成20bp左右的短双链RNA片断，然后这些短双链RNA的单链与RNA诱导沉默复合体（RISC）结合，指导RISC结合并剪切靶mRNA以达到特定基因沉默的作用。这些长20bp左右的短双链RNA片断被称为小干扰RNA（siRNA），它是RNA干扰机制的核心。siRNA基因沉默技术克服了传统反义核酸策略的诸多缺陷，是目前为止发现的最为强劲且最有前途的基因抑制方法。但siRNA的特异性及抑制效率也会被一些因素所影响，如何避免这些因素的干扰是应用此项技术不可回避的问题。本研究首先针对cyclinA2基因设计并合成三对不同序列的siRNA，靶向骨肉瘤细胞MG-63及正常人成纤维细胞HSF的cyclinA2基因进行沉默，通过在不同时间点检测三对不同序列siRNA作用下两种细胞cyclinA2的表达，选择出基因抑制效率最高的siRNA序列，同时确定最佳抑制浓度及时间。然后用筛选出的siRNA特异性的抑制骨肉瘤细胞MG-63及正常人成纤维细胞HSF内cyclinA2的表达，通过检测两种细胞增殖活性、细胞周期、平板克隆形成能力及相关基因表达的变化，探讨cyclinA2在骨肉瘤发生发展中的地位，以及能否作为新的基因靶点应用于骨肉瘤的治疗。第一部分不同序列的cyclinA2-siRNA对骨肉瘤及成纤维细胞cyclinA2基因的沉默作用目的研究三对不同序列的siRNA对骨肉瘤细胞MG-63及正常人成纤维细胞HSF中cyclinA2基因mRNA及蛋白表达的抑制作用，挑选最佳抑制序列并确定最适抑制浓度及时间。方法设计并化学合成三对靶向cyclinA2基因的siRNA：siRNA1、siRNA2和siRNA3，同时设计并合成一对与任何基因无同源性的无义siRNA。用质脂体LipofectamineTM2000将各组siRNA分别转染骨肉瘤MG-63细胞及正常成纤维细胞HSF，以磷酸缓冲液PBS替代siRNA进行转染作为空白对照，以无义siRNA转染作为阴性对照。除剂量实验中浓度梯度为1nM、10nM、50nM、100nM外，其余实验均转染50nM浓度的siRNAs。分别用荧光实时定量PCR、western-blot检测cyclinA2 mRNA及蛋白表达的沉默效果。结果1．在骨肉瘤细胞MG-63中，3组cyclinA2-siRNA在24h、48h、72h均能使cyclinA2的mRNA表达降低（P＜0.05），并在48h抑制效率最高，其后有下降趋势。siRNA1组细胞cyclinA2的mRNA含量在3个时间点均低于siRNA2组（P＜0.05）和siRNA3组（P＜0.05）。对照组siRNA对cyclinA2的mRNA表达无影响。2．1nM、10nM、50nM、100nM浓度的siRNA1转染MG-63细胞48h后，分别可使cyclinA2 mRNA表达降低12.4％，54.3％，80.6％和84.5％，其中10nM、50nM及100nM组cyclinA2的mRNA含量与空白组相比均有显著差异（P＜0.01），同时50nM及100nM组的mRNA含量低于10nM组（P＜0.05），而50nM组与100nM组相比无明显差异（P＞0.05）。3．同样浓度梯度的siRNA1转染MG-63细胞48h后，cyclinA2蛋白表达相应降低，与其mRNA下降水平一致。4．在正常成纤维细胞HSF中，3对cyclinA2-siRNA在转染后48h分别使cyclinA2的mRNA表达降低58.1％，39.0％和40.2％，其中siRNA1组细胞cyclinA2的mRNA含量最低（与另2对比较P＜0.05）。对照组siRNA对cyclinA2的mRNA表达无影响。siRNA1转染HSF细胞48h后cyclinA2的蛋白表达降低63.3％。结论1．3对cyclinA2-siRNA均能抑制骨肉瘤及成纤维细胞中cyclinA2基因的表达，其中siRNA1抑制效率高于另外2对。2．siRNA1在转染后48h基因抑制效率最高并在50nM浓度以下存在着剂量依赖性，高于50nM浓度其基因抑制效率并无明显增加。3．选取化学合成的siRNA并以低浓度进行细胞转染是防止siRNA脱靶效应及非特异效应产生的有效措施。第二部分沉默cyclinA2基因对骨肉瘤及成纤维细胞增殖的影响目的研究沉默cyclinA2基因的表达对骨肉瘤细胞MG-63及正常人成纤维细胞HSF的生长影响，探讨cyclinA2在骨肉瘤细胞增殖中的作用及抑制其表达作为骨肉瘤治疗方法的可行性。方法用LipofectamineTM2000将siRNA1分别转染骨肉瘤MG-63细胞及正常成纤维细胞HSF。MG-63细胞转染10nM及50nM两种浓度的siRNA1，HSF细胞只转染50nM浓度的siRNA1。以PBS替代siRNA进行转染作为空白对照，对照组转染50nM无义siRNA。采用四唑盐比色法（MTT）评价细胞的增殖活性。流式细胞（FCM）周期检测评价细胞周期分布的改变。RT-PCR评价cyclinB1及PCNA基因表达的变化。转染后继续培养14～18天，平板克隆培养法观察细胞克隆形成情况。结果1．MG-63细胞经10nM及50nM siRNA1转染24h、48h、72h后，两种浓度的siRNA1在各时间点对细胞增殖能力均有明显抑制作用（P＜0.05），并在48h抑制率达到最高，分别为39.1％和54.9％；用50nM的siRNA1转染HSF细胞后，在以上3个时间点未显示对细胞增殖有明显影响（P＞0.05）。对照siRNA对两种细胞均无增殖抑制作用（与空白组比较P＞0.05）2．MG-63细胞转染10nM及50nM siRNA1 48h后，G0／G1期细胞均明显增多（较空白组p＜0.05）。HSF细胞经50nM siRNA1转染后，空白组、对照组及siRNA组G0／G1期细胞分别占74.3％±6.7％，75.1％±5.6％及80.4％±6.8％，表明HSF细胞在无siRNA干预时即有大量细胞聚集于G0／G1期，siRNA1的干预未导致G0／G1期细胞数量改变（P＞0.05）。两种细胞对照组周期分布较空白组均无明显改变（P＞0.05）。3．以50nM siRNA1转染MG-63细胞48h后，cyclinA2、PCNA及cyclinB1的mRNA相对含量分别下降了76.5％、72.4％及80.2％，较各自空白组均有明显差异（P＜0.01）。4．MG-63细胞经10nM及50nM siRNA1转染并继续培养14天后，克隆形成率均明显降低（与空白组相比P＜0.05）；50nM siRNA1转染HSF细胞并继续培养18天后，细胞平板克隆形成能力未受明显影响（与空白组相比P＞0.05）。结论1．降低cyclinA2基因的表达能有效抑制骨肉瘤细胞的增殖，导致其细胞周期出现G0／G1期阻滞且克隆形成能力降低。同时PCNA及cyclinB1的表达亦随之下降。2．降低cyclinA2基因的表达对正常成纤维细胞的生长无明显影响。3．CyclinA2是骨肉瘤细胞增殖所依赖的关键基因，其有望成为骨肉瘤基因治疗的新靶点。