研究背景:蚊虫可传播疟疾、乙脑、黄热病、登革热、基孔肯雅热、寨卡病毒病等多种疾病,近期,巴西等南美洲国家发生寨卡病毒暴发疫情,引起全球广泛关注。白纹伊蚊产于东亚,白天觅食,比埃及伊蚊有更高的叮咬频率,是当前最具侵袭性的蚊种,过去30年中,这一物种已经从本土发源地亚洲东南部蔓延扩散至全世界除了南极洲以外的六个洲近50个国家和地区,是目前世界多个国家和地区最重要的登革媒介之一,也是中国登革传播的主要媒介,自1978年广东佛山首次暴发登革热以来,广东省已发生过大小不等的登革热流行,近年来更常有暴发流行,2002年5月,广东省出现登革热的暴发流行,仅广州市就发生1422例;2014年我国广东省及东南亚地区多个国家发生登革热疫情,在近20年是最高的,根据广东省登革疫情通报,截止2014年12月15日,广东省全年累计确诊登革病例45171例,其中广州37354例,死亡6例。全球有超过三分之一的人口生活在登革易感区域,每年有超过四十亿的人口感染登革病毒。有文献报道白纹伊蚊对于寨卡病毒也有携带和传播能力。虽然2015年11月首只登革疫苗已经在巴西、墨西哥和菲律宾开始使用,但迄今效果并不理想,且9岁以下儿童不在适用范围之内,预防登革热最行之有效的方法是从控制传染源和传播媒介方面着手,蚊媒种群的控制是迄今登革热预防的唯一有效途径,拟除虫菊酯类杀虫剂,因为其高效、低毒、经济等有优点,不仅在高密度白纹伊蚊的公共区域,也是农业领域应用最为广发的杀虫剂,为世界卫生组织(WHO)主要推荐的成蚊杀虫剂。拟除虫菊酯类杀虫剂在公共卫生的媒介控制和在农业病虫害控制领域作用显著,但其对蚊虫种群造成了巨大的选择性压力,抗性白纹伊蚊群体在印度、中国、巴基斯坦、马来西亚、泰国和马达加斯加等地报道。尽管蚊类的杀虫剂抗药性增长迅猛,但由于缺乏其他行之有效、成本效益高的替代措施,化学类杀虫剂仍然是现今蚊媒控制的最主要手段。蚊媒杀虫剂抗药性认识包括两个方面:1)影响杀虫剂结合位点亲和性的靶标位点突变(靶标抗性);2)杀虫剂到达目标位点前的代谢解毒作用(代谢抗性)。针对第一种机理,电压门控钠离子通道Voltage-Gated Sodium Channelgene(VGSC),是拟除虫菊酯的作用靶标。在跨越不同蚊种的各种抗性研究文献中,仅有一小部分氨基酸位点发生VGSC基因非同义突变,可通过基因扩增的方法进行抗性诊断如冈比亚按蚊An.gambia的L1014F位点突变。而第二种机理,解毒酶类如酯酶、P450单加氧酶、谷胱甘肽S转移酶(GST)扮演了重要角色。除上述两种抗性机制外,其他机理如外皮增厚、消化道改变以防止或减少杀虫剂渗透、吸收,均对杀虫剂抗性的发展起到一定作用。新的基因组学方法将为杀虫剂抗药性机理研究带来全新的整体理解,其中一种高性价比方法为转录组测序法(RNA-seq),已经应用于蚊媒的研究,进行了不吉按蚊An.funestus和埃及伊蚊Ae.aepti特定阶段特定组织的denovo转录组装配和表达谱分析,冈比亚按蚊An.gambia的喂血前后表达谱分析等等,尚未见该技术应用于白纹伊蚊抗性相关研究。RNA干扰通过人为引入与内源靶标基因具有相同序列的双链RNA,是当前对于基因功能性研究最行之有效的方法之一,为功能基因组学的研究提供了更加快捷方便的工具。SNP称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),作为一种新型的分子遗传标记,由于需要大量单个样本,成本较高,统计学上要求增加SNP的密度以提高攻击学准确性。近十几年通过生物信息学,从分子水平理解蛋白质与底物之间的相互作用,是区别于传统方法通过分子生物学手段通过表达对应蛋白继而研究蛋白特性的来新兴研究工具。具体对比核酸序列,根据SNP引起的氨基酸突变,通过同源建模的方法,可以对不同表型的SNP位点与蛋白结构的影响建立显著性关联,是针对SNP进行研究的新方法。实验目的:本研究以目前全球分布最为广泛的“亚洲虎纹”——白纹伊蚊为研究对象,通过在世界不同地区采集野外白纹伊蚊样本,检测其击倒抗性(kdr)突变频率;通过中国南方广东省各地采集野外白纹伊蚊样本,检测其对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性水平和击倒抗性(kdr)突变频率;通过对白纹伊蚊拟除虫菊酯类杀虫剂抗性和敏感群体的转录组基因分析、抗性相关基因的分布以及聚类特征分析,进行杀虫剂抗性基因的筛选。此外,我们通过RNA干扰减少抗性候选基因在白纹伊蚊雌蚊中的表达量,继而研究RNA干扰后蚊虫的拟除虫菊酯杀虫剂抗性改变。通过同源建模的方法,探索不同P450酶的单核苷酸多态性与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的相关性。实验方法:分别从亚洲、非洲、北美南美以及欧洲在内的全世界12个国家和地区现场采集597只白纹伊蚊,检测单只蚊钠离子通道基因三个区域共1107bp的基因突变。采用世界卫生组织(WHO)推荐的生物接触桶法,测定中国南方的广州和深圳两个白纹伊蚊种群对溴氰菊酯杀虫剂的抗性水平,并比较kdr突变和抗性表型的相关性。在对中国南方深圳白纹伊蚊进行成蚊生测后,分别提取对溴氰菊酯杀虫剂抗性和敏感的3-5日龄单只雌性成蚊总RNA共24只,并分别制备24个上机文库然后用Illumina的HiSeq4000测序平台进行转录组测序;通过使用CLCGenomicworkbench对高通量转录组数据经去街头、聚类拼接、DEGs等分析。通过选取部分基因在抗感白纹伊蚊雌性个体进行qRT-PCR,验证RNA-seq的正确性;通过对SNP数据的分析,对SNP进行分子标记的筛选。采用两种RNA干扰方法,通过口服干扰和显微注射干扰分别针对3条候选基因,P450细胞色素酶Cyp6a8和两条无基因注释的基因Unknown gene1和Unknown gene2,分别在白纹伊蚊实验室敏感株的幼虫和成蚊进行干扰实验,并在干扰后,用qPCR检测证干扰后目标基因在幼虫和成蚊的表达水平变化。然后根据实验结果,分别就3条候选基因,分别用两种RNA干扰方法对白纹伊蚊实验室抗性株进行口服干扰和显微注射成蚊干扰,并在干扰后,通过qPCR法检测蚊体内靶标基因的表达水平变化,并对干扰后的抗性蚊进行WHO成蚊标准生测不同候选基因,不同干扰方法对抗性水平的影响。通过统计分析挑选候选SNP,进行敏感种群和抗性种群的基因频率检测,根据检测结果,经过生物信息学方法通过生物信息学软件分析和预测氨基酸突变位位置,对SNP对P450酶的影响进行预测。根据基因的cDNA序列,在蛋白质结构数据库中挑选合适的同源序列来作为比照的参考模板,通过BLAST,在PDB数据库中搜索。根据最佳匹配度,选择已知功能和已知晶体结构的CYP3A4蛋白结构作为比照模板。选择好模板后,根据目标蛋白氨基酸突变前后的氨基酸突变和模板蛋白模型进行同源比对,然后进行与溴氰菊酯的分子对接。此外,根据氨基酸突变位点,对突变功能进行预测。实验结果:在钠离子通道基因的Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ区域,共检测到29种同义突变。从4个国家的5个白纹伊蚊种群中检测到了两种非同义突变,其中在意大利的罗马种群检测到1532位点的突变,为一种新的突变类型(I1532T),其突变频率为19.7%。第二种新型突变发生在1534位点(F1534S),发生该突变的种群包括中国的两个种群和美国的佛罗里达州,突变频率为9.5%和22.6%。现场采集的中国南方两个白纹伊蚊接触溴氰菊酯杀虫剂24h后的死亡率分别为90.1%和96.1%,根据WHO判定抗性的标准,属于存在抗性和可能存在抗性。溴氰菊酯杀虫剂抗性和kdr突变存在正相关。研究通过RNA-seq法建立了白纹伊蚊的抗溴氰菊酯杀虫剂转录本数据库,发现11090个白纹伊蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性相关转录本,通过分析转录组转录本的基因注释,发现其中具有统计学差异的742个转录本,进行了 GO功能注释;其中选取的部分代谢酶、免疫基因等qPCR见证结果与RNA-seq结果吻合。其中发现有部分Cyp基因和1条GST基因在敏感蚊中表达倍数是抗性蚊的2倍以上。另外,发现了 1418个SNP分子标记位点。通过筛选抗性相关基因和SNP等分子标记物,为白纹伊蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性机理研究的进一步发展提供了新的基础。口服siRNA纳米微粒效果与显微注射siRNA对靶标基因的干扰效果无显著却别,同样能起到对靶标基因的基因沉默效应,3条目的基因Cyp6a8,Unknown gene 1,Unknown gene 2在进行RNA干扰之后,表达量均不同程度有所下降,降低水平均超过50%-60%。实验室抗性品系白纹伊蚊经过RNA干扰之后,WHO抗性生测显示抗性水平下降,与抗性株白纹伊蚊生测24小时死亡率90.5%相比,变为100%。其中Unknown gene1与白纹伊蚊的成蚊发育有关,该基因仅在成蚊期的雌雄蚊体内表达,在幼虫时期不表达。对8条P450基因的9个SNP位点进行了突变氨基酸位置预测。根据白纹伊蚊抗性和敏感种群的突变检测结果,其中5个突变位点与溴氰菊酯杀虫剂抗性呈正相关性,该5个SNP均对溴氰菊酯小分子与P450蛋白模型的分子对接无直接影响。对其中4个突变位点进行功能假说,两个位点Arg226Ser和Cys212Ser位于蛋白的门户F-G开合环(F/G loop)上,对溴氰菊酯小分子进入P450蛋白开始进行进行反应,以及反应结束后代谢产物排出产生影响,Leu282Arg位于P450酶与其FMN氧化还原反应的参与蛋白的FMN协同反应连接界面上,对协同反应的蛋白连接之间具有一定的影响。Pro175Gln对于P450细胞色素酶的蛋白结构稳定性具有维持作用。研究结论:1.首次报道了两种新的kdr突变,通过对12个国家和地区的白纹伊蚊VGSC基因检测,首次发现了 I1532T和F1534S两种新kdr突变。其中I1532T发现于意大利白纹伊蚊,F1534S发现于中国和美国的白纹伊蚊种群。2.首次通过成蚊生测证明中国南方的广东省两个城市广州和深圳的白纹伊蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂已开始产生抗性,因此我们需要对目前在消除登革热阶段推荐的在疫点采用拟除虫菊酯杀虫剂进行媒介控制的杀虫剂种类、有效计量和效果进行评估,以消除对实现消除登革目标的潜在威胁,同时号召通过杀虫剂轮换或替换措施的方法延缓白纹伊蚊对拟除虫菊酯杀虫剂抗性的产生和发展。3.成功在白纹伊蚊建立了 kdr突变与抗性表型的直接关系,证明VGSC基因1534位点的kdr突变和蚊体针对溴氰菊酯的保护性之间存在显著相关性,具有作为白纹伊蚊抗性生物标记的潜在可能。4.首次采用RNA-seq法构对单只白纹伊蚊进行了拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关转录本数据建库,并筛选出一批与白纹伊蚊杀虫剂抗性相关的未注释功能基因,SNP等分子标记物。为白纹伊蚊拟除虫菊酯杀虫剂抗性机理的进一步研究提供了新的基础。5.对Cyp6a8基因和2条未知基因进行干扰,能够成功降低白纹伊蚊的拟除虫菊酯杀虫剂抗性。6.持续口服siRNA纳米复合微粒的作用效果可以持续至成蚊阶段,该种方法对靶标基因的干扰效果与成蚊干扰方法无差别,优点在实验蚊虫不会产生应激反应,不会造成蚊虫死亡。7.通过同源比对的形式首次对白纹伊蚊P450细胞色素酶相关基因的9个SNP进行了蛋白结构中突变位点的预测,并就白纹伊蚊野生种群中显著存在的SNP进行了功能假说,其中2个SNP可能通过影响蛋白结构的F/G开合环起作用(Arg226Ser和Cys212Ser),Leu282Arg与氧化还原反应的共同反应物NADH-FMN氧化还原酶位置靠近,因此可能对酶的反应有一定的影响,Pro175Gln突变通过影响P450细胞色素酶的蛋白结构稳定性对代谢解毒产生影响。