雷竹14-3-3基因家族克隆和功能分析

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14-3-3蛋白是广泛存在于真核生物中一类高度保守的蛋白,在植物中,14-3-3蛋白调控一系列生理生化过程。拟南芥中14-3-3蛋白与CO互作调控光周期途径从而调控开花,水稻中14-3-3蛋白与FT互作对开花起负调控作用,因此,14-3-3家族基因的克隆对营养生长周期比较长的竹类植物成花机理的研究有重要的意义。本研究从雷竹(Phyllostachys violascens)中获得4个14-3-3家族基因,进行了表达特性分析,通过转基因对其进行功能分析,探究其蛋白质的亚细胞定位;利用酵母双杂交研究雷竹GF14c蛋白与雷竹FT之间的相互作用,主要的研究结果如下:1、从雷竹中克隆到4个14-3-3蛋白同源基因,分别命名PvGF14b、PvGF14c、PvGF14e、PvGF14f,PvGF14b基因组DNA全长为2160bp,cDNA全长958bp,包含5个外显子和4个内含子,编码262个氨基酸残基。PvGF14c基因组DNA全长为1935bp,cDNA全长1086bp,包含5个外显子和4个内含子,编码256个氨基酸残基。PvGF14e基因组DNA全长为2130bp,cDNA全长882bp,包含5个外显子和4个内含子,编码262个氨基酸残基。PvGF14f基因组DNA全长为2160bp,cDNA全长1045bp,包含5个外显子和4个内含子,编码261个氨基酸残基。2、RT-PCR分析显示,这4个基因在开花前后的表达量没有差异,且PvGF14c在开花前后的表达量比其他3个基因高。PvGF14b、PvGF14c在24小时内均有表达,无昼夜节律性。PvGF14b在根、茎、花中表达量稍高,其次是老叶,在幼叶的中表达量较低;PvGF14c在叶中表达量最高,在茎中表达量微量表达;在根和花中没有检测到表达,PvGF14e在根中表达量最低;PvGF1f在茎中表达量最高,其次是老叶和花,在幼叶中表达量微量表达,在根中没有检测到表达。提示PvGF14c可能与雷竹开花有关。3、构建PvGF14c-GFP融合表达载体,并将其导入洋葱表皮细胞,进行亚细胞定位研究。结果表明PvGF14c蛋白定位在细胞质中。4、通过酵母双杂交实验验证了雷竹PvGF14c蛋白与雷竹PvFT蛋白互作。5、转PvGF14c基因拟南芥T2代比野生型拟南芥晚开花。获得31株转PvGF14b基因拟南芥。同时获得17株转PvGF14e和15株PvGF14f的拟南芥植株。
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