一、研究目的及意义：恶性黑色素瘤多发于皮肤、内脏,临床治疗效果不佳。近年来,基因疗法尤其是自杀基因疗法取得了一定的进展。但在研究过程中也逐渐发现不少问题,如自杀基因前体药物活性较低、毒副作用大,载体转染效率不高等,这些问题导致肿瘤自杀基因治疗达不到预想的治疗效果。由于自杀基因系统存在旁杀伤效应的现象,于是通过应用其旁杀伤效应可以提高肿瘤自杀基因治疗的效果。传统的中药方药具有多靶点、多途径作用的特点以及广泛的药理作用,而且价格低廉、毒副作用小,因此中医经典复方联合自杀基因治疗成为我们治疗肿瘤的一种新的尝试。本课题组前期研究结果：体内体外实验表明滋阴补肾经典名方六味地黄丸可以提高自杀基因系统对肿瘤杀伤效应。任何一种药物发挥它的药效必有其作用的物质基础,六味地黄丸之所以能提高肿瘤自杀基因系统的杀伤效应其物质基础是什么?通过哪种机制发挥效应?在前期研究的基础上,我们提出研究假说：“六味地黄丸主要血中移行成分是六味地黄丸提高肿瘤自杀基因系统杀伤效应的物质基础”,并对该假设体外实验进行了验证,结果表明从六味地黄丸的主要的5种血中移行成分的单体及混合5种移行成分与六味地黄丸提高黑色素瘤自杀基因疗法的杀伤效应并无直接的药效关系,但这混合5种移行成分作用于淋巴细胞后,取其细胞上清,发现含药淋巴细胞培养上清对HSV-tk/GCV系统的杀伤B16细胞具有协同增效作用,其增效机制可能为免疫介导及缝隙连接机制。在此基础上,我们设想六味地黄丸主要血中移行成分在体内应该也能增效自杀基因系统杀伤黑色素瘤,并探讨其相应的增效机制,与前面体外实验相呼应共同验证六味地黄丸主要血中移行成分是六味地黄丸提高肿瘤自杀基因系统杀伤效应的物质基础的假说。二、研究方法：1.六味地黄丸入血成分对HSV-tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞增效作用的体内实验最适实验条件摸索1.1鉴定在体内实验中HSV-tk/GCV系统的活性：将单纯的B16/tk细胞接种于小鼠腋下,给予不同剂量的GCV,观察疗效,鉴定tk基因的活性。1.2确定tk+细胞的混合比例及GCV的工作浓度：将GCV的剂量固定为50mg/kg·d, B16/tk细胞与B16细胞按20%、40%、60%的比例混合,观察疗效,确定最适的混合比例；将B16/tk细胞与B16细胞按40%的比例混合(依据前期实验结果预估的最适混合比例),分别给予50mg/kg·d、100mg/kg·d、200mg/kg·d剂量的GCV,观察疗效,并综合前期实验结果确定最适GCV给药剂量。1.3确定六味地黄丸入血成分与GCV的联合剂量：将GCV给药剂量设定为50mg/kg·d, B16/tk细胞与B16细胞的混合比例为1：1,丹皮酚：(马钱子苷+獐牙菜苷+莫诺苷)：5-羟甲基-2-糠酸3：8：1的质量比例,混合入血成分的剂量为20mg/kg·d,设置模型组、GCV组、混合入血成分组、GCV联合混合入血成分组,观察疗效,确定最适的混合入血成分剂量。2.六味地黄丸入血成分对HSV-tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞增效作用的体内实验：将GCV给药剂量设定为50mg/kg·d, B16/tk细胞与B16细胞的混合比例为1：1,混合入血成分剂量为15mg/kg·d,六味地黄丸给药剂量为lOg/kg·d,设置正常组、模型组、GCV组、GCV联合混合入血成分组、GCV联合六味地黄丸组,观察疗效。3.六味地黄丸入血成分作用小鼠后外周血血清的制备及对HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤增效作用的研究3.1六味地黄丸入血成分作用小鼠后外周血血清的制备：设模型组、混合入血成分组,供接种B16/tk细胞与B16细胞的混合比例为1：1,混合入血成分组给药剂量为15mg/kg·d,成瘤后治疗14天,眼球取血,4℃过夜后离心获取小鼠血清,-20℃保存备用,其中模型组血清为对照血清,混合入血成分组血清为含药血清。3.2MTT检测六味地黄丸入血成分作用小鼠后外周血血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤增效作用按占培养液总体积10%血清加入培养体系,B16/tk细胞与B16细胞的混合比例为3：7,设置对照组(加培养液)、0%含药血清组(10%对照血清)、GCV联合0%含药血清组(10%对照血清)、GCV联合2.5%含药血清组(2.5%含药血清混合7.5%对照血清)、GCV联合5%含药血清组(5%含药血清混合5%对照血清)、GCV联合7.5%含药血清组(7.5%含药血清混合2.5%对照血清)、GCV联合10%含药血清组(10%含药血清),GCV的终浓度为30μmol/L, MTT检测细胞抑制率。3.3荧光示踪法检测六味地黄丸入血成分作用小鼠后外周血血清对HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤增效作用按占培养液总体积10%血清加入培养体系,B16/tk细胞与B16细胞的混合比例为1：1,设置对照组(加培养液)、GCV组、GCV联合0%含药血清组(10%对照血清)、GCV联合2.5%含药血清组(2.5%含药血清混合7.5%对照血清)、GCV联合5%含药血清组(5%含药血清混合5%对照血清)、GCV联合7.5%含药血清组(7.5%含药血清混合2.5%对照血清)、GCV联合10%含药血清组(10%含药血清),GCV的终浓度为25μmol/L,荧光显微镜观察红绿荧光细胞的凋亡情况。三、研究结果：1.六味地黄丸入血成分对HSV-tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞增效作用最适实验条件摸索1.1HSV-tk/GCV系统体内实验模型可成功构建,其中50mg/kg·d剂量的GCV组抑瘤率为78.3%,100mg/kg·d剂量的GCV组抑瘤率为85.8%。1.2GCV的给药剂量确定为50mg/kg·d较合适,其中50mg/kg·d剂量的GCV组抑瘤率为61.3%,100mg/kg·d剂量的GCV组抑瘤率为82.2%,200mg/kg·d剂量的GCV组抑瘤率为94.0%。tk+细胞的混合比例确定为50%,其中20%tk+细胞抑瘤率为17.8%,40%tk+细胞抑瘤率为61.3%,60%tk+细胞抑瘤率为73.4%。1.3混合入血成分的剂量确定为15mg/kg·d,其中GCV组抑瘤率5.5%,混合入血成分组抑瘤率36.6%,GCV联合混合入血成分组抑瘤率30.1%。2.六味地黄丸入血成分对HSV-tk/GCV系统杀伤黑色素瘤B16细胞具有增效作用2.1成瘤时间及成瘤率：除模型组一只未出瘤外,各组均于接种后8天触及肿瘤；成瘤率如下所示模型对照组(93%)、GCV组(100%)、混合入血成分组(100%)、GCV联合混合入血成分组(100%),GCV联合六味地黄丸组(100%)。2.2肿瘤体积(单位：mm3)及肿瘤生长体积曲线：随着治疗进行,GCV组及GCV联合混合入血成分组以及GC.V联合六味地黄丸组肿瘤体积与模型对照组间的差别逐渐增大；从曲线来看,肿瘤呈现生长抑制状态,两组联合治疗组更明显；治疗结束时肿瘤体积GCV组及GCV联合混合入血成分组以及GCV联合六味地黄丸组与模型对照组之间差异有统计学意义(P<0.01)。2.3肿瘤质量(单位：g)及抑瘤率：模型组(5.3378±0.3095g)、混合入血成分组(4.6591±0.3572g,12.7%)、GCV组(2.8959±0.6147g,45.7%),GCV联合混合入血成分组(1.7059±0.1001g,68.0%),GCV联合六味地黄丸组(1.9135±0.17538,64.2%),GCV组和两组联合治疗组肿瘤质量均较模型组轻,且该三组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。2.4病理检查：肉眼观察,GCV及2组GCV联合治疗组体积较小,以GCV联合混合入血成分组最明显。镜下：2组GCV联合治疗组肿瘤细胞密度相对较低,肿瘤组织周围有较多纤维结缔组织增生。结果显示GCV联合混合入血成分对小鼠移植性恶性黑色素瘤生长具有抑制作用,其疗效优于单纯GCV治疗和混合入血成分,与GCV联合六味地黄丸疗效相当。3六味地黄丸混合入血成分作用小鼠后外周血血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗黑色素瘤有一定的增效作用3.1MTT检测法显示含药血清能在一定程度上增效自杀基因系统杀伤黑色素瘤B16细胞,将各GGCV联合血清组相对抑制率按含药血清浓度从低到高依次为46.4±4.14%%、61.9±3.03%、57.1±1.61%、80.1±1.22%。其中GCV联合2.5%含药血清组与GCV联合对照血清组比较差异具有统计学意义(P<0.01), GCV联合5%含药血清组与GCV联合对照血清组比较差异具有统计学意义(P<0.05), GCV联合10%含药血清组与GCV联合对照血清组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。3.2荧光示踪法显示含药血清能在一定程度上增效自杀基因系统杀伤黑色素瘤B16细胞,具体为GCV联合10%含药血清组绿色荧光细胞周围有红色细胞碎片漂浮现象较其余浓度组更明显。四、结论：实验所得结论为：六味地黄丸入血成分对自杀基因系统体内治疗黑色素瘤有增效作用,六味地黄丸入血成分体内作用小鼠取得的小鼠血清在体外研究中对自杀基因杀伤黑色素瘤有一定的增效作用。