论文部分内容阅读
目的 研究钌化合物对铜绿假单胞菌的光动力(Photodynamic therapy, PDT)杀伤作用,初步观察其在体抗感染效果。方法(1)铜绿假单胞菌ATCC 27853、PAO1和3株临床分离的PA1、PA2、PA3,配成108CFU/ml细菌悬液,将Ru光敏剂(PS)按不同浓度与其混合后孵育30 min,用波长457 nm激光,功率密度40 mW/cm2,照射时间10 min进行PDT处理,另设完全空白、单纯光敏剂、单纯照光对照组。各组在处理后采用稀释平板法计数观察PDT对浮游菌的杀伤作用。并电镜观察PDT后细菌超微结构的变化。(2)培养PAO1生物被膜,进行PDT处理(照光参数同上)。处理后采用结晶紫染色光镜观察PAO1生物被膜结构变化,MTT法检测细菌活性。另设单纯光敏剂、单纯照光和完全空白对照组。以扫描电镜观察生物被膜经PDT处理后超微结构的改变。(3)测定加入外排泵抑制剂前后PDT对铜绿假单胞菌PA1和PAO1的杀伤。根据加入PAβ N和光敏剂的先后顺序,分为单纯PS、同时加入、先外排泵抑制剂(Efflux pump inhibitor, EPI)后PS和先PS后EPI组,PDT处理后,测定细菌活性。同时采用吸收光谱法检测各组中与细菌结合的PS含量。(4)采用胶带撕脱法建立小鼠皮肤PAO1感染模型,将24只感染小鼠分为PDT和单纯感染组,每组12只。PDT后即刻、24h剪取感染皮肤(n=6),平板计数单位皮肤中的细菌数。PDT后观察大体变化,行病理组织学检查(n=3)。结果(1)不同浓度Ru-PDT对5株铜绿假单胞菌均有杀伤。光敏剂在浓度10μM时,5株铜绿假单胞菌活性均降低4 Log以上。电镜观察发现,PDT后细菌内外膜遭到破坏,胞内容物从膜结构上的裂缝中释放。(2)随光敏剂浓度的增加,生物被膜内细菌活性在PDT处理后降低。在相同PDT条件下,Ru-PDT对被膜内细菌的作用较对浮游菌弱。25μM-PDT处理可明显破坏生物被膜结构的完整性,清除菌体及胞外基质。(3)加入PAβN可增强PDT的作用效果。先加PAβN再加PS组PDT对细菌的杀伤作用最强,与细菌结合的光敏剂含量最高。先加PS再加PAβN时,PDT杀伤效果最差。(4)PDT后细菌负荷明显低于空白对照组(p<0.01),并达到了有效杀伤标准(细菌数降低>3 Log)。24h时有细菌再生长现象,但PDT处理后24h细菌负荷仍然低于感染2h和24h组。PDT处理后小鼠皮肤创面有明显的缩小结论：1. Ru-PDT具有杀伤铜绿假单胞菌的作用,其机制可能是通过破坏细菌膜结构的完整性引起胞质成分外泄,导致细菌死亡。2. Ru-PDT具有杀伤铜绿假单胞菌生物被膜内细菌及破坏被膜的作用。PDT对生物被膜内细菌的杀伤比对浮游菌的杀伤弱。3.外排泵抑制剂PA β N可以增强Ru-PDT作用,可能是通过抑制细菌外排泵,减少光敏剂排出菌体外而起作用。4.PDT干预可有效杀伤皮肤感染灶内病菌,减少炎症反应,促进创面愈合。