芽孢杆菌抗菌脂肽的分离纯化及Bacillomycin D抑制黄曲霉作用的研究

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抗菌脂肽是由芽孢杆菌属通过非核糖体途径合成的的具有抗细菌、真菌、病毒和支原体功能的脂肽类化合物。此外,脂肽还具有很强的表面活性。因此,抗菌脂肽在食品、化妆品、生物防治、生物医药以及石油工业、生物修复等领域有着广泛的应用前景。为了对脂肽进行更深入、更广泛的研究,需要建立各种脂肽纯品的制备方法,为进一步的应用提供理论依据和技术支持。本研究建立了surfactin、fengycin的制备方法;利用制备的fengycin纯品在高效液相色谱上建立了fengycin的检测方法;对fmbj菌株中抑制黄曲霉的活性物质进行了分离鉴定并建立了其制备的方法,对其抑制黄曲霉的作用进行了研究,主要研究结果如下:1.建立了surfactin纯品的制备方法。通过酸沉淀、有机溶剂抽提、柱层析、制备色谱建立了surfactin的制备方法,经抑菌实验、溶血实验以及液相检测保留时间与surfactin标品的保留时间对比知,此方法简单有效。2.建立了fengycin屯品的制备方法并在HPLC上建立了fengycin的检测方法。通过酸沉淀、有机溶剂提取、柱层析、制备色谱、冷冻干燥建立了从Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4发酵液中制备fengycin的方法,经抑菌实验、HPLC分析、LC-MS以及MS-MS分析知fengycin的纯度较高。利用制备的fengycin纯品,建立了一种用高效液相色谱测定发酵液中fengycin含量的新方法。该方法采用色谱柱为Agilent C18柱,4.6mm×250mm×0.5μm色谱柱,以乙腈(含0.1%三氟乙酸)和水(含0.1%三氟乙酸)为流动相,流速0.6mL/min梯度洗脱,205nm紫外(DAD)检测。结果表明:运用本方法在5-1000mg/L范围内fengycin浓度与积分面积之间具良好的相关性(r=0.9997),精密度为1.7673%,检出限5mg/L。3.对Bacillus subtilis fmbj中抑制黄曲霉的活性物质进行了分离鉴定。通过酸沉淀、有机溶剂提取、Sephadex LH-20柱层析和制备型HPLC等一系列分离纯化步骤,从枯草芽孢杆菌fmbJ的发酵液中分离纯化得到对黄曲霉有抑制作用的1-6号活性峰。经LC-MS分析知fmbj发酵液中对黄曲霉有抑制作用的物质是分子量为1030、1044、1058、1072的Bacillomycin D的4种同系物。在制备色谱上建立了Bacillomycin D纯品的制备方法,通过抑菌谱实验发现Bacillomycin D对各种霉菌均有很强的抑制作用。4.利用制备的Bacillomycin D纯品,对其抑制黄曲霉的作用进行了研究。Bacillomycin D对黄曲霉病菌的菌丝生长、孢子萌发和产孢能力都具有明显的抑制作用。对黄曲霉病菌孢子的最小抑菌浓度(MIC)为Bacillomycin D0.05mg/mL,最小致死浓度(MFC)为Bacillomycin D0.2mg/mL。通过扫描电镜和透射电镜观察发现:Bacillomycin D作用后不但可以引起菌丝和孢子表面形态的变化,还可以破坏细胞壁,穿过细胞膜,破坏细胞内部结构。
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