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黄河鲤是世界上最早养殖的淡水重要鱼类之一,为了提高其经济价值,中国水产科学研究院淡水渔业研究中心经过多年的选育已获得增长速度较快和肌肉中不饱和脂肪酸含量较高的黄河鲤新品系。为了加快其遗传进展,通常采用分子辅助育种技术手段来缩短世代间隔以进行后续选育。由于基因型检测的成本通常较高,一般通过结合传统的BLUP估计、候选个体的预选择和选择有限个候选功能位点开展分子辅助育种,这种方法是平衡选育成本和加大选育进展的有效途径。本研究先利用上述方法筛选黄河鲤新品系F2的优势样本作为亲本,从而进一步繁育获得了黄河鲤新品系F3,并从DNA和RNA水平分析了黄河鲤新品系F3优异的靶性能(增长速度较快和肌肉中不饱和脂肪酸含量较高)有关的多态位点分子标记和差异表达基因以及通路,并验证了在生长性能中发挥重要作用的基因(如IGF2a和IGF2b)的功能。研究结果不仅丰富了黄河鲤新品系选育分子标记储备,而且丰富了黄河鲤新品系优异靶性能的遗传机理的理论基础,这些工作可为黄河鲤新品种的选育提供技术和理论基础,亦可为其它水生动物开展类似育种工作提供参考。本研究主要内容及结果如下:
(1)选取黄河鲤新品系F2代亲本和子代共450尾,利用5对微卫星引物和4个基因区段扩增引物开展基因型检测,同时检测它们与体重的关联性并进行相应的遗传效应分析。结果显示:Koi42和4个SNPs位点对体重有显著的影响,获得具有超过2个优势基因型的候选亲本共13尾,富集优势分子标记基因型的候选亲本生长性能优势明显。通过多元逐步回归分析,利用AIC最佳模型筛选到COI626,D-Loop253和Koi42共3个位点,发现Koi42贡献率较大,经Fisher精确性检验发现其与性别存在关联,所产生的加性效应接近显著水平(P<0.05)。检测的多个上位效应组分中,仅有D-Loop253和Koi42的加性效应间的互作达到显著水平。这些结果提示Koi42及与其有互作的D-Loop253可用于黄河鲤新品系的标记辅助选择,开展多个分子标记的富集选择。
(2)利用(1)中分子标记辅助选育的黄河鲤新品系第3代(黄河鲤新品系F3)8个月生长速度提高20.84%,同时肌肉中多不饱和脂肪酸含量显著提高8.9%。为了进一步从全基因组水平筛选与优异性能有关的分子标记,本文采用2b-RAD技术分析优异生长性能有关的数量性状位点或基因,构建了黄河鲤新品系F3共25个家系,计250个(每个家系1对亲本+8个F4子代)样本用于2b-RAD测序,获得56,663个SNPs,覆盖50个染色体和3,370个scaffold;筛选了244个主要与性别和营养代谢有关的位点,检测到8个与生长有关的QTL。同时发现,3月龄的体长、3月龄和8月龄体重均由多基因控制,而8月龄的体长、体厚和体高由3-6个主效基因控制,其中Fst和QTL重叠的结果是位于21号染色体上的IGF2基因(经注释发现鲤中存在IGF2a和IGF2b两个基因),其可以部分控制体长、体厚和体高。
(3)基于(2)研究中发现IGF2基因包含与体长、体厚和体高等性能相关的分子标记,可以看出该基因在生长性能方面可能发挥着重要的作用。为了进一步验证IGF2基因的功能,采用CRISPR-Cas9方法分别敲除了IGF2a和IGF2b基因,结果发现IGF2a基因可以调节雄性斑马鱼的生长速度。IGF2a和IGF2b基因可通过不同基因型来影响2个生长阶段黄河鲤新品系的生长。
(4)为了进一步探究基因的表达量是否影响黄河鲤新品系生长速度的一个重要因素,本研究对黄河鲤新品系选育组和对照组的肠道转录组进行了比较分析,并进行了qPCR验证。结果发现106个差异表达基因,其中与内吞作用相关的基因(如il2rb和ehd1等)表达水平显著,而ehd1基因位于Gh/IGF生长轴上,是调控哺乳动物生长的关键基因;与肠道再生有关的基因,在选育组中表达上调,表明黄河鲤新品系较高的生长性能与内吞作用的高效性有关。
(1)选取黄河鲤新品系F2代亲本和子代共450尾,利用5对微卫星引物和4个基因区段扩增引物开展基因型检测,同时检测它们与体重的关联性并进行相应的遗传效应分析。结果显示:Koi42和4个SNPs位点对体重有显著的影响,获得具有超过2个优势基因型的候选亲本共13尾,富集优势分子标记基因型的候选亲本生长性能优势明显。通过多元逐步回归分析,利用AIC最佳模型筛选到COI626,D-Loop253和Koi42共3个位点,发现Koi42贡献率较大,经Fisher精确性检验发现其与性别存在关联,所产生的加性效应接近显著水平(P<0.05)。检测的多个上位效应组分中,仅有D-Loop253和Koi42的加性效应间的互作达到显著水平。这些结果提示Koi42及与其有互作的D-Loop253可用于黄河鲤新品系的标记辅助选择,开展多个分子标记的富集选择。
(2)利用(1)中分子标记辅助选育的黄河鲤新品系第3代(黄河鲤新品系F3)8个月生长速度提高20.84%,同时肌肉中多不饱和脂肪酸含量显著提高8.9%。为了进一步从全基因组水平筛选与优异性能有关的分子标记,本文采用2b-RAD技术分析优异生长性能有关的数量性状位点或基因,构建了黄河鲤新品系F3共25个家系,计250个(每个家系1对亲本+8个F4子代)样本用于2b-RAD测序,获得56,663个SNPs,覆盖50个染色体和3,370个scaffold;筛选了244个主要与性别和营养代谢有关的位点,检测到8个与生长有关的QTL。同时发现,3月龄的体长、3月龄和8月龄体重均由多基因控制,而8月龄的体长、体厚和体高由3-6个主效基因控制,其中Fst和QTL重叠的结果是位于21号染色体上的IGF2基因(经注释发现鲤中存在IGF2a和IGF2b两个基因),其可以部分控制体长、体厚和体高。
(3)基于(2)研究中发现IGF2基因包含与体长、体厚和体高等性能相关的分子标记,可以看出该基因在生长性能方面可能发挥着重要的作用。为了进一步验证IGF2基因的功能,采用CRISPR-Cas9方法分别敲除了IGF2a和IGF2b基因,结果发现IGF2a基因可以调节雄性斑马鱼的生长速度。IGF2a和IGF2b基因可通过不同基因型来影响2个生长阶段黄河鲤新品系的生长。
(4)为了进一步探究基因的表达量是否影响黄河鲤新品系生长速度的一个重要因素,本研究对黄河鲤新品系选育组和对照组的肠道转录组进行了比较分析,并进行了qPCR验证。结果发现106个差异表达基因,其中与内吞作用相关的基因(如il2rb和ehd1等)表达水平显著,而ehd1基因位于Gh/IGF生长轴上,是调控哺乳动物生长的关键基因;与肠道再生有关的基因,在选育组中表达上调,表明黄河鲤新品系较高的生长性能与内吞作用的高效性有关。