背景:上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指上皮细胞通过特定程序转化为间充质细胞,进而获得迁移和增殖能力的过程。有研究表明年龄相关性黄斑变性和增殖性玻璃体视网膜病变等视网膜纤维化疾病的发病机制涉及视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞的EMT,具体表现为细胞连接丧失,细胞骨架重排及成分改变,增殖和迁移能力增强等,但关于RPE细胞EMT的启动机制,目前尚未完全阐明。近年来,细胞外基质（extracellular matrix,ECM）刚度对细胞生物学功能的调控作用受到广泛的关注,在生理和病理情况下,视网膜ECM刚度是发生改变的,有报道证明Bruch膜的刚度随着年龄的增长可以增加至少一个数量级,而且基质刚度改变已被证实可以影响RPE细胞吞噬和炎症诱导因子的表达,但基质刚度是否调控RPE细胞的EMT过程尚待研究证实。因此,本研究拟通过构建不同刚度聚丙烯酰胺水凝胶以模拟体内视网膜ECM刚度的变化,利用形态学、功能表型和分子生物学的研究方法探究基质刚度是否可以促进RPE细胞的EMT过程,并探讨其背后的分子调控机制。方法:本研究构建不同刚度（5kPa、10kPa、20kPa和40kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶,通过纳米压痕仪检测其弹性模量（刚度的定量指标）,通过原子力显微镜检测其表面粗糙度,利用I型鼠尾胶原增加其表面细胞粘附活性,通过CCK-8检测不同刚度水凝胶浸提液的细胞毒性以验证其安全性。将ARPE-19细胞培养在不同刚度水凝胶和塑料培养板上,通过Calcein AM染色技术检测不同基质刚度对ARPE-19细胞增殖的影响;通过免疫荧光染色技术检测不同基质刚度对ARPE-19细胞中F-肌动蛋白细胞骨架组装和排布的影响;通过CultureInsert检测不同基质刚度对ARPE-19细胞迁移的影响;通过Western-blot检测不同基质刚度对ARPE-19细胞中上皮标志性蛋白（E-钙粘蛋白和闭锁连接蛋白-1）和间充质标志性蛋白（波形蛋白）的影响。结果:本研究成功制备了不同刚度的ECM体外模型,各组水凝胶的实际弹性模量分别为5.45±0.62k Pa、10.89±1.39k Pa、20.91±1.34k Pa和41.07±1.40k Pa,这与理论值基本相符;覆盖I型鼠尾胶原的水凝胶表面最大锥形凸起高度为2.60nm,这对尺寸为μm级别的ARPE-19细胞影响忽略不计;各组水凝胶浸提液对ARPE-19细胞增殖活性影响无差异,这表明了水凝胶的安全性。本研究发现随着基质刚度增加,ARPE-19细胞的形态从圆球形转变为长梭形,平均细胞面积和平均细胞纵横比增加,这表明基质刚度的增加促进ARPE-19细胞从上皮细胞形态转变为间充质细胞形态。随着基质刚度增加,F-肌动蛋白细胞骨架的组装增强、应力纤维的形成增多,F-肌动蛋白细胞骨架在低刚度组（5k Pa）表现为弥漫分布,无法形成纤维束或仅在细胞边缘形成短小的纤维束;在高刚度组（40k Pa）表现为粗长的纤维网络,所形成的应力纤维横跨整个细胞,这表明基质刚度的增加可以促进F-肌动蛋白细胞骨架的组装和应力纤维的形成。ARPE-19细胞在单位面积的细胞总面积随着基质刚度的增加而增加,这表明基质刚度增加促进ARPE-19细胞的增殖。ARPE-19细胞的相对迁移面积随着基质刚度增加而增加,这表明基质刚度的增加促进ARPE-19细胞的迁移。此外,本研究发现随着基质刚度增加,ARPE-19细胞中上皮标志性蛋白E-钙粘蛋白和闭锁连接蛋白-1表达水平降低,间充质标志性蛋白波形蛋白的表达水平升高。结论:基质刚度增加影响ARPE-19细胞的形态,促进F-肌动蛋白细胞骨架组装和应力纤维形成,促进ARPE-19细胞的增殖和迁移,抑制上皮标志性蛋白E-钙粘蛋白和闭锁连接蛋白-1的表达,促进间充质标志性蛋白波形蛋白的表达水平。以上研究结果从形态学、功能表型和蛋白表达三方面证明了基质刚度的增加可以促进ARPE-19细胞发生EMT。