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基于猴病毒40(SV40)载体在COS7细胞内的复制没有节制并对细胞具有致死性,长期以来SV40载体-COS7系统只被用作瞬时表达。本研究的最初设想是通过在SV40载体的复制中引入负反馈机制,而使载体能在COS7细胞进行稳定表达。pctPA是实验中作为对照的重组质粒,该质粒是含SV40复制起始点(ori)_、t-PA(人组织型纤溶酶原激活剂)基因和新霉素筛选基因的SV40载体。鉴于pctPA的复制失控潜能,我们推测其难以在COS7细胞内建立稳定的转染。但结果与预期的相反,COS7细胞转染pctPA并以G418筛选4周后,长出多个形态与正常COS7细胞相似的抗性克隆。Southern Blot分析显示,在稳定的COS7抗性细胞中,质粒pctPA以染色体外附加体的形式存在,平均每细胞约含300个拷贝。提示载体在COS7细胞中的复制受到反式抑制。在COS7抗性细胞的培养液上清中,溶圈实验检测到t-PA的表达,其表达量约为1.1μg/10~6细胞/天,与质粒pctPA在COS7作瞬时表达时(转染后48h)的水平相近。但在细胞传代中无G418压力时,t-PA表达水平迅速下降。 在G418减半维持下(250μg/ml),观察了COS7细胞形成稳定抗性克隆之后3个月内tPA的表达水平及细胞内附加体拷贝数的变化。随细胞的传代t-PA的表达在一个月内相对稳定,维持在1μg/10~6细胞/天左右的水平。之后下降趋势明显,在第96天时表达仅为0.1μg/10~6细胞/天。对细胞附加体拷贝数的Southern Blot分析显示出相似的变化趋势,在传代后第一个月末约有262个/细胞,但至第三个月末拷贝数仅为83个/细胞。相反,细胞内大T抗原的含量随着细胞传代,而逐渐增加,并逐渐接近于COS7细胞转染质粒前的水平。 这些实验表明,单一的SV40载体(指除SV40 ori外不含其它的复制调控元