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前言胆石症目前在世界上仍然是常见病、多发病之一。在我国临床实践中,胆固醇结石好发于胆囊,胆色素结石好发于肝胆管系统,尤以肝内胆管常见(占90%以上)。胆囊结石可手术切除而治愈,但胆管结石疗效尚不满意,表现为手术后结石残余率、复发率高,手术并发症发生率和再手术率较高,那么研究胆色素结石的发病原因以及预防就有了实际的意义。早在20世纪50年代就有报道肝内胆管结石源于细菌感染,可伴胆管狭窄,致病情反复难愈。胆石症病人胆汁中细菌的检出率高提示了细菌感染和胆色素结石形成之间有密切的关系。但细菌的来源说法不一,有血源性、返流性、移位性多种学说,可能同时并存。我们在近期对胆色素结石的研究工作中注意到,饮食诱导的豚鼠胆囊胆色素结石形成过程中,肠黏膜屏障中机械屏障及肠黏膜通透性方面存在异常,这一点提示我们,肠黏膜屏障功能异常在胆色素结石形成的某些环节中发挥一定的作用。遵循这一逻辑思维,鉴于门静脉系统的特殊解剖结构,当肠黏膜屏障功能发生异常时,肠道内的细菌是否在某些因素的作用下,透过肠壁、通过血液和淋巴管道,侵及肝胆系统,进而促进胆色素结石的形成。基于以上想法,我们在饮食诱导的豚鼠胆囊胆色素结石模型中,用细菌分类培养的方法,观察肠道内细菌菌群数量的变化;用免疫组化的方法,观察肠黏膜免疫细胞和分子数量的变化,借此反应肠黏膜免疫功能,并进一步应用肠黏膜保护剂谷氨酰胺进行干预。从正反二个方面,来观察肠黏膜屏障功能与胆色素结石形成之间的关系,从一个新的角度来初步探讨胆色素结石的形成机制和可能的预防手段。实验方法一、实验对象豚鼠95只,雌性48只,雄性47只,体质量210～250g,适应性饲养一周后,按照随机原则分为四组:对照组(CON组)15只,给予普通豚鼠饲料,饲养8周;致石组(PS组)30只,给予致石饲料,饲养8周;短期致石组(STPS组)20只,给予致石饲料,饲养4周;谷氨酰胺组(GLN组)30只,给予添加谷氨酰胺的致石饲料,饲养8周。各组均处于相同的饲养条件下,投饵量一致。二、标本采集1、胆囊胆色素结石标本以10%水合氯醛按照3ml/kg腹腔注射麻醉后,将豚鼠固定于解剖台,腹部高效碘消毒,取腹部正中切口开腹,含胆汁取下胆囊,囊内胆汁及胆石可凭肉眼清晰辨别,采用双盲法操作并记录成石情况。2、回肠内容物及回肠病理标本开腹后,寻找到回盲部,取末端回肠2cm,纵向剖开,收集肠内容物后,称重、放入无菌小瓶中。回肠标本用生理盐水清洗三遍,用剪刀裁成1cm长的小段,用10%的中性福尔马林浸泡。每操作一个豚鼠更换一套无菌手术器械。三、检测指标1、致石率评定及红外光谱结石定性解剖显露豚鼠胆囊,肉眼即可清晰辨别胆囊结石形成情况,采用红外光谱溴化钾压片法,对结石成分进行定性,统计结石形成率。2、豚鼠回肠内容物细菌分类培养取回肠内容物,依浓度稀释后在肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌培养基上进行需氧和厌氧培养,并计数。3、计算肠道细菌定植抗力双歧杆菌与肠杆菌的数量比值(B/E值)。4、豚鼠肠黏膜免疫细胞和分子检测采用免疫组化法,测定肠黏膜内抗原递呈细胞、B细胞、浆细胞的数量和肠黏膜表面SIgA的含量。实验结果1、豚鼠胆囊胆色素结石模型构建情况饲养8周后,CON组豚鼠偶见结石形成,PS组成石率为68.42%,GLN组成石率为38.89%,GLN组低于PS组(p＜0.05),另饲养4周的STPS组成石率为36.36%,低于PS组(p＜0.05)。结石定性为胆色素结石。2、豚鼠回肠内容物细菌分类培养结果与CON组相比,PS组肠杆菌、肠球菌的量明显升高,乳杆菌、双歧杆菌的量明显降低(p＜0.05);STPS组肠杆菌的量明显升高,双歧杆菌的量明显降低(p＜0.05);GLN组双歧杆菌的量明显降低(p＜0.05)。3、肠道细菌定植抗力与CON组B/E值(1.77+0.65)相比,致石组B/E值(1.33±0.31)降低(p＜0.05)。4、豚鼠肠黏膜免疫细胞和分子检测与CON组相比,STPS组肠黏膜固有层内DC细胞数增加,抗原表达增强、增多(p＜0.05);PS组肠黏膜固有层内B细胞数、浆细胞数和黏膜表面SIgA含量减少,抗原表达减弱、减少(p＜0.05)。结论1、胆色素结石的形成与肠黏膜屏障功能异常具有一定相关性。2、服用肠黏膜保护剂谷氨酰胺可预防胆色素结石的形成。