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第一部分氟对SH-SY5Y细胞自噬的影响目的:氟是人体所必需的微量元素,广泛存在于自然界中。过量的氟除了损害骨骼系统,还能损害包括中枢神经系统在内的软组织。有研究表明,自噬功能缺陷与氟导致的雄性生殖系统损害作用有关,但自噬在氟致神经毒性中的作用少有报道。故本研究旨在探讨Na F对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬的影响,为进一步阐明氟的神经毒作用机制提供理论依据。方法:用不同浓度(20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100mg/L)的氟化钠(Sodium fluoride,Na F)染毒SH-SY5Y细胞24小时(h),采用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,并根据存活率结果选取适宜的Na F染毒浓度进行后续实验;用选取的Na F浓度染毒SH-SY5Y细胞24 h,采用透射电子显微镜观察细胞内自噬体超微结构;采用吖啶橙染色观察细胞内自噬囊泡的生成;采用Western blotting技术检测自噬相关蛋白Atg5(autophagy related gene 5)和LC3(microtubule-associated protein1 light chain 3)与自噬降解相关蛋白P62的表达水平。结果:随着NaF染毒剂量的增加,细胞活力逐渐降低,并呈现剂量反应关系。与对照组比较,Na F染毒浓度在30 mg/L及以下时,对SH-SY5Y细胞毒性作用不明显,差异无统计学意义(P>0.05);而Na F染毒浓度在40 mg/L及以上时,细胞活力显著降低,且与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。因80 mg/L及100 mg/L染毒浓度下细胞相对存活率低于50%,故为进一步开展后续研究最终确定Na F染毒浓度为20 mg/L、40 mg/L和60 mg/L;透射电子显微镜下可观察到细胞内典型自噬体结构,且随Na F染毒剂量的增加自噬体数量明显减少;吖啶橙染色可见,与对照组相比,40mg/L和60 mg/L Na F染毒组自噬囊泡数量逐渐减少,尤以60 mg/L Na F染毒组减少最为明显;Western blotting检测发现,与对照组相比,Atg5和LC3-II的表达水平呈剂量依赖性降低,而P62的表达水平呈剂量依赖性升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:一定剂量的Na F可抑制SH-SY5Y细胞的自噬活性。第二部分自噬对氟诱导SH-SY5Y细胞氧化应激和凋亡的影响目的:本课题第一部分研究发现,一定剂量的氟能降低SH-SY5Y细胞存活率,并抑制自噬活性,那么上调细胞自噬水平是否可以缓解氟诱导的SH-SY5Y细胞毒性?本研究采用自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,RAP)干预,通过上调自噬水平,研究自噬对氟诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激和凋亡的影响。方法:用不同浓度(20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L)的Na F染毒SH-SY5Y细胞24小时,采用流式细胞仪检测细胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成及细胞凋亡率水平;采用Western blotting技术检测凋亡相关蛋白半胱氨酸—门冬氨酸特异蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase-3)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase,PARP)蛋白表达水平;RAP干预实验分组情况:Control、Na F(60 mg/L)、RAP(100 nmol/L)和Na F+RAP,用以上四组分别染毒SH-SY5Y细胞24 h,采用Western blotting技术检测自噬相关蛋白LC3和P62的表达水平;采用流式细胞仪检测RAP干预上调自噬水平后对氟诱导的SH-SY5Y细胞ROS和凋亡率的影响。结果:随着Na F染毒浓度的增加,细胞ROS生成逐渐增多,细胞凋亡率逐渐增加,且与对照组相比,40 mg/L和60 mg/L Na F染毒组差异均具有统计学意义(P<0.05);凋亡相关蛋白检测发现,随着Na F染毒剂量的增加,Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP表达水平逐渐增高,与对照组比,40 mg/L和60 mg/L Na F染毒组差异均具有统计学意义(P<0.05);RAP联合Na F对SH-SY5Y细胞自噬相关蛋白表达水平的影响,发现与对照组相比,单纯Na F(60 mg/L)染毒组LC3-II表达水平降低,P62表达水平增加,且差异具有统计学意义(P<0.05);与单纯Na F染毒组比较,Na F与RAP联合作用组LC3-II表达水平增加,P62表达水平降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。RAP联合Na F对SH-SY5Y细胞活性氧生成的影响,发现与对照组相比,单纯Na F染毒组细胞内ROS水平明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。与单纯Na F染毒组比较,Na F与RAP联合作用组细胞内ROS水平明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。RAP联合Na F对SH-SY5Y细胞凋亡率的影响,发现与对照组相比,单纯Na F染毒组凋亡率明显增加,且差异具有统计学意义(P<0.05)。与单纯Na F染毒组比较,Na F与RAP联合作用组凋亡率明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:RAP干预上调自噬水平可缓解氟引起的SH-SY5Y细胞氧化应激和细胞凋亡,即自噬对氟诱导的SH-SY5Y细胞毒性损伤起保护作用。