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紫杉醇是由红豆杉属植物产生的一类天然次生代谢产物,属于二萜类化合物,通过促进微管稳定和稳定已聚合的微管而达到抑制肿瘤细胞生长的作用,目前已经在临床上用于卵巢癌和乳腺癌的治疗。由于红豆杉生长缓慢且紫杉醇产量极低,因此寻找新的紫杉醇药物来源一直是研究的热点所在。随着紫杉醇生物合成途径中关键酶作用机制的逐步阐明,利用代谢工程以及组合生物合成的方法在微生物中异源表达紫杉醇及其前体药物已经成为可能。灰盖鬼伞属于大型真菌的模式生物,具有独特的天然萜类物质代谢池,理论上适合作为紫杉醇代谢工程的异源宿主。
本研究从南方红豆杉和蔓地亚红豆杉中克隆出5个紫杉醇下游合成途径的关键酶基因,并运用生物信息学的方法对它们进行了序列分析;分别采用灵芝gpd启动子和香菇小片段gpd启动子连接GGPPS、TS以及DBAT基因,构建了6个真核表达载体;选取表达载体pgLes-DBAT遗传转化灰盖鬼伞原生质体,利用高效液相色谱对工程菌株发酵液成分进行初步分析。主要研究结果如下:
(1)蔓地亚红豆杉紫杉烷2α-羟基化酶基因全长cDNA序列和完整DNA序列扩增。利用PCR技术从蔓地亚红豆杉基因组DNA中克隆出完整的DNA序列,共1659bp:根据DNA的序列信息设计特异性引物,利用外显子拼接法扩增得到cDNA全长序列,长度为1488bp,编码495个氨基酸残基,相对分子量为55.5kD,等电点为9.54,含有2个内含子,具有细胞色素P450超家族保守结构域。
(2)南方红豆杉紫杉烷13α-羟化酶基因全长cDNA序列和完整DNA序列扩增。利用PCR和RT-PCR技术分别克隆得到基因组DNA序列和cDNA全长序列,长度分别为1843bp和1458bp。推导其cDNA序列编码485个氨基酸残基,相对分子量为54.6kD,等电点为8.94,含有2个内含子,保守结构域分析显示该蛋白质属于P450超家族。
(3)蔓地亚红豆杉和南方红豆杉3-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶(DBTNBT)基因全长cDNA序列和完整DNA序列扩增。利用PCR和RT-PCR技术从蔓地亚红豆杉和南方红豆杉分别克隆得到基因组DNA序列和cDNA全长序列,两个树种中的DNA序列和cDNA全长序列长度一致,均为1418bp和1317bp。推导其cDNA序列编码438个氨基酸残基,相对分子量均为48.2kD,等电点均为6.03,都含有1个内含子和转移酶超家族保守结构域。
(4)南方红豆杉紫杉烷14β-羟化酶基因全长cDNA序列和完整DNA序列扩增。利用PCR和RT-PCR技术分别克隆得到基因组DNA序列和cDNA全长序列,长度分别为1799bp和1530bp。推导其cDNA序列编码509个氨基酸残基,相对分子量为57.1kD,等电点为8.98,含有2个内含子,保守结构域分析显示该蛋白质属于P450超家族。
(5)南方红豆杉10-去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰转移酶(DBAT)基因全长cDNA序列和完整DNA序列扩增。利用PCR和RT-PCR技术分别克隆得到基因组DNA序列和cDNA全长序列,长度分别为1557bp和1323bp。推导其cDNA序列编码440个氨基酸残基,相对分子量为49.2kD,等电点为6.48,含有2个内含子,保守结构域分析显示该蛋白质属于转移酶超家族。
(6)选用GGPPS和TS基因以及本论文克隆的DBAT基因,分别与灵芝gpd启动子(gpdl-GI)和香菇小片段gpd启动子(gpd-Les)连接,以表达载体pBlucscriptⅡ KS(+)为框架,构建真核表达载体。重组质粒经过酶切鉴定和测序鉴定后,将构建成功的载体命名为:pgLes-GGPPS(gpd-Les-+GGPPS)、pgLes-TS(gpd-Les+TS)、pgLes-DBAT(gpd-Les+DBAT)、pBgGI-GGPPS(gpdl-GI+GGPPS)、pgGIgpd-TS(gpdl-GI+TS)、pBgGI-DBAT(gpdl-GI+DBAT)。
(7)DBAT基因在灰盖鬼伞中的异源表达研究。表达载体pgLes-DBAT与恢复载体pCc1001通过PEG介导法共转化灰盖鬼伞色氨酸缺陷性菌株LT2,通过最小培养基进行初筛,通过PCR鉴定和SDS-PAGE进行复筛,通过观察表观生长情况确定目的基因是否成功表达,获得8个真实阳性转化子,选取部分阳性转化子进行摇瓶培养并提取发酵液中的萜类成分进行高效液相色谱的分离检测,检测结果显示,底物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ经过工程菌株的作用后转化为目标产物巴卡亭Ⅲ。