蛋白质及多肽类药物是药物领域研究的热点之一,因为这类生物大分子具有很高的药效专一性,并且在很多疾病治疗中无可替代。通过将蛋白质微粒化,可以避免注射给药,使其通过非侵入式给药途径吸收。蛋白与其它组分的复合微粒化,则可能带来缓释效果,并能促进药物吸收等。为了使蛋白质微粒系统在特定的给药途径中有效地传输,并起到预期的作用,微粒的组成、形貌、粒径及其分布需要严格的控制。因此微粒制备过程的开发与应用基础研究非常重要。同时,蛋白质结构和生物活性极易受到破坏,因而对于微粒化过程的要求更高。强化混合的超临界流体辅助雾化技术(SAA-HCM)利用超临界流体对溶液的辅助雾化作用制备超细微粒,并采用水力空化现象强化超临界二氧化碳(SCCO2)与溶液的混合,其对微粒的形貌和粒径控制能力强,过程条件较为温和,是一项应用前景极为广阔的绿色微粒化技术。SAA-HCM不但可以处理有机溶剂体系,尤其可以从水溶液中制备水溶性物质,因此此过程有望用于蛋白质及多肽类药物微粒化。目前,SAA-HCM过程的研究仍处在发展阶段,已有的应用对象多为小分子药物以及聚合物,在蛋白质微粒化的应用方面鲜有报道,关于功能性辅料和药用蛋白质的复合微粒系统研究则仍为空白。本研究将SAA-HCM技术的应用拓展到蛋白类药物的微粒化过程。论文按照“模型蛋白基础研究→药用蛋白基础研究→聚合物/药用蛋白复合体系基础研究→聚合物/药用蛋白复合体系应用基础研究”的基本思路展开。对SAA-HCM过程制备蛋白质药物微粒系统的基础问题进行深入研究,得出了蛋白质微粒化和聚合物/蛋白质微粒化过程中微粒形成的一般规律,为蛋白质微粒化过程提供指导；对蛋白质的结构和活性进行系统的表征和分析,获得了蛋白质分子在微粒化及保存过程中结构和活性变化的大量信息,为蛋白质微粒化过程中的结构和活性优化提供依据；制备得到具有独特性质的蛋白质/聚合物复合微粒体系,并表征了药物体内作用特点,为其进一步应用指明了方向。首先,选取溶菌酶为模型蛋白,探究了SAA-HCM过程制备蛋白质超细微粒的可行性和规律。可以得到形貌均一,界面清晰且分散的溶菌酶超细微粒。微粒的粒径既可以达到适合肺部吸入式给药的1-5μm,亦可以分布在亚微米级,可用于注射使用。研究过程参数对于微粒形貌和粒径的影响,结果表明沉淀器温度和溶剂组成对形貌至关重要,而混合器温度对微粒形貌同样有明显的影响。压力及溶液浓度则对粒径影响显著,CO2与水溶液的气液质量流量比对粒径的影响较使用有机溶液体系时弱。SAA-HCM具有很宽的操作窗口,除了在一些较为极端的温度和压力操作条件下,制得的溶菌酶微粒与原料相比活性均保持在85%以上。经过SAA-HCM处理后溶菌酶化学结构保持良好,没有出现降解或聚集；溶液中高级结构保持完整,而固态下折叠结构少量增加；热稳定性维持不变,变性温度保持在204.8℃,而水含量略有升高,至5.54%；微粒为无定形状态。对比了SAA-HCM和喷雾干燥、传统盐析结晶手段制备的溶菌酶产品的各项性质,证实了SAA-HCM中SCCO2对于粒径控制的重要作用,与喷雾干燥的产品相比,微粒粒径大大降低,分布更窄更均匀,结构和活性保持更佳,且能长期保存。在溶菌酶微粒化研究的基础上,研究了利用SAA-HCM从水溶液中制备药用蛋白胰岛素超细微粒的过程。溶解条件、沉淀器温度以及溶液浓度的改变会得到褶皱、高度折叠、部分塌陷以及光滑的多种微粒表面形貌。溶液浓度对于胰岛素微粒粒径有明显影响,可以制备得到分布于0.5-5μm胰岛素超细微粒,且胰岛素分子的化学结构及高级结构均可以完好保持,水含量在7%左右与原料相当。通过大鼠体内试验,发现处理后胰岛素完整保持了其体内生物活性。提出了胰岛素溶液液滴干燥到微粒形成的蛋白成壳机理,较好地阐释胰岛素微粒制备中多种形貌形成的过程,并可用于其他蛋白质微粒化过程的解释和指导中。在胰岛素微粒化研究的基础上,利用SAA-HCM过程从水溶液中制备了胰岛素/壳聚糖复合超细微粒。复合微粒表面具有连续的波纹型褶皱,且随着蛋白质含量增大而愈加明显。壳聚糖和胰岛素投料比以及溶液浓度对粒径影响明显,粒径在0.3-5μm间可控。蛋白结构和热行为的表征和分析说明胰岛素与壳聚糖分子在复合微粒中存在相互作用,显著降低了胰岛素的螺旋结构成分,而重新溶解于水溶液后,胰岛素高级结构基本恢复；而胰岛素的分散形式为固体溶液分子级分散,且壳聚糖的作用可防止胰岛素在长期存放过程中的降解。着重考察了胰岛素分子在复合微球中的空间分布,发现胰岛素具有表面富集的行为,验证了蛋白成壳机理的正确性。复合微球的载药效率可达93.4%,胰岛素在浸没于溶液条件下释放较快,最快可在4h内释放完全,且存在突释与吸附行为的结合,而在模拟肺部黏膜条件下释放较慢,8h仅释放30%。最后,将胰岛素的空间分布与复合微球形貌和胰岛素释放行为相关联,可对微球形貌控制和蛋白释放起到指导作用。在胰岛素复合微球成功制备的基础上,进一步进行应用导向的研究。基于SAA-HCM过程可制备具有高吸湿性的壳寡糖的超细微粒,水含量最低可以控制在6%以下。利用此过程从水溶液中制备了胰岛素/壳寡糖复合超细微粒。研究了胰岛素经过复合后结构的稳定性以及在复合微粒中的分布情况。复合微粒载药效率可达87.3%。制备了具有较高可吸入比例(52.3%)的复合微球,并以此复合微球进行胰岛素大鼠体内药物吸收试验,结果表明,肺部给药后,壳寡糖复合微球促进了胰岛素分子经过肺部黏膜的吸收,药效生物利用度达到48.9%,展示了这种复合微球体系在胰岛素肺部吸入式给药途径中的优势。SAA-HCM过程能够成功地应用于蛋白质类药物微粒的制备中,过程避免了有机溶剂的使用,操作条件对于蛋白质结构和活性的保持比较有利,制备得到的微粒形貌和粒径分布在较大范围内可有效控制。利用此技术将胰岛素与壳聚糖/壳寡糖复合得到的复合微粒系统在蛋白质非侵入式给药途径尤其是肺部吸入式给药途径中具有很好的应用前景。