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第一部分暴发性1型糖尿病患者外周血免疫学特征的研究目的随着自身免疫检测手段的发展和多种胰岛自身抗原的应用,学者们对暴发性1型糖尿病(FT1DM)的免疫学认识发生了改变。本部分主要探讨FT1DM患者外周血的自身免疫和调节性T细胞功能特征。方法放射配体法检测谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)及锌转运体8抗体(ZnT8A)在22例FT1DM患者中的分布。密度梯度离心法分离10例FT1DM患者和10例正常对照的外周血单个核细胞(PBMCs)。酶联免疫斑点法(ELISpot)检测谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛素(Insulin)、C肽(C-peptide)反应性T细胞。Real-time PCR检测干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、RAR相关孤儿受体C (RORC)、白细胞介素-17(IL-17)、叉头状蛋白3(Foxp3).细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、白细胞介素-10(L-10)及转化生长因子β (TGF-β)的mRNA水平。结果完成胰岛自身抗体检测的22例FT1DM患者中,9例患者至少有1个抗体阳性,阳性率41%(9/22)。GADA、IA-2A及ZnT8A阳性例数分别为5例、2例和3例。完成胰岛抗原反应性T细胞检测的10例FT1DM患者中,8例患者至少有1种胰岛抗原反应性T细胞,阳性率80%(8/10)。GAD、C肽及胰岛素反应性T细胞阳性例数分别为7例、4例及4例。与正常对照相比,FT1DM患者PBMCs中IFN-γ的mRNA水平升高,Foxp3的mRNA水平降低(P=0.02,P<0.01)。结论自身免疫和调节性T细胞异常可能参与了部分暴发性1型糖尿病的发生。第二部分暴发性1型糖尿病患者外周血单个核细胞Foxp3基因启动子区域甲基化异常的研究目的表观遗传学参与了多种自身免疫疾病的发生,但暴发性1型糖尿病中的表观遗传学研究尚无报道。本部分从DNA甲基化修饰的角度探讨FT1DM患者外周血单个核细胞中Foxp3低表达的机制。方法密度梯度离心法分离10例FT1DM患者和10正常对照的外周血单个核细胞(PBMCs)。总体甲基化定量试剂盒检测PBMCs的基因组DNA总体甲基化水平。real-time PCR检测DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a及DNMT3)的mRNA水平。Western-blot检测Foxp3蛋白表达水平。亚硫酸氢钠测序检测Foxp3基因启动子区域的甲基化水平。结果与正常对照组相比,FT1DM患者PBMCs基因组DNA总体甲基化水平增高(P=0.017)。DNMT1的mRNA水平明显增高(P=0.032)。Foxp3蛋白表达水平降低(P<0.05),且其启动子区域呈明显的高甲基化(P<0.05)。Foxp3的mRNA水平与其启动子区域甲基化水平呈负相关(r=-0.709,P<0.01)。结论FT1DM患者外周血单个核细胞Foxp3的表达下降与其启动子区域高甲基化状态相关。第三部分CpG ODN通过TLR9/IRF7通路调控外周血单个核细胞中Foxp3基因表达的研究目的暴发性1型糖尿病(FT1DM)患者外周血TLR9和Foxp3表达均降低,但其关系及机制尚不清楚。本部分初步在正常人外周血单个核细胞中研究TLR9/IRF7通路对Foxp3基因表达的影响,为进一步研究其是否参与FT1DM的发生提供依据。方法real-time PCR验证表达谱芯片筛选天然免疫相关差异表达基因TLR9的表达；生物信息学软件预测调控Foxp3基因的转录因子；通过获得和缺失的方法,运用real-time PCR和Western-blot检测IRF7对Foxp3的mRNA和蛋白水平表达的影响；荧光素酶报告载体试验检测IRF7对Foxp3转录活性的影响；采用染色质免疫沉淀法鉴定出IRF7在Foxp3启动子的结合位点；运用real-time PCR和Western-blot检测CpG ODN处理后Foxp3的表达情况及对Foxp3靶基因表达的改变；运用免疫荧光及siRNA干扰技术证明检测CpG ODN对Foxp3表达的调控通过IRF7介导。结果FT1DM患者PBMCs中TLR9的mRNA水平表达降低(P<0.05)；通过生物信息学软件预测到Foxp3的转录因子干扰素调节因子7(IRF7); IRF7上调PBMCs中Foxp3mRNA和蛋白水平的表达(P<0.05)；IRF7能促进Foxp3的转录活性(P<0.05)；IRF7在Foxp3启动子的结合位点位于Foxp3转录起始位点上游处；CpG ODN可以通过激活TLR9/IRF7通路上调Foxp3的表达(P<0.05)。结论CpG ODN通过TLR9/IRF7通路上调外周血单个核细胞中Foxp3的表达。