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猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronaviruses,PDCoV)属于冠状病毒科δ冠状病毒属,2012年在香港的猪群中检测到该病毒,并于2014年在美国爆发后在全世界范围传播。目前还没有可用于猪δ冠状病毒诊断和预防的商用试剂或疫苗,因此对猪δ冠状病毒疫苗和诊断方法的研究是非常重要的。猪δ冠状病毒E蛋白和S蛋白是该病毒的重要结构蛋白,在病毒成熟过程中S蛋白被蛋白酶切割成S1和S2,S2区域比较保守,抗原位点和变异区主要在S1区域;E蛋白是小包膜蛋白,对于猪δ冠状病毒在宿主的组装和侵染有重要作用。本研究将猪δ冠状病毒HKU15-44株E蛋白和S1蛋白作为抗原分别免疫新西兰兔,并对兔子产生的抗体效价进行测定。研究结果如下:1猪δ冠状病毒E蛋白载体构建与表达本研究合成的质粒pET21b-pSUMO-CoVE所表达的目的蛋白可溶性部分占比87%,可溶性良好但目的蛋白不便于纯化。利用PCR的方法将6×His标签与pET21b-pSUMO-CoVE质粒重组构建pET21b-6×His-pSUMO-CoVE重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)。诱导表达后经SDS-PAGE检测,结果表明成功构建了pET21b-6×His-pSUMO-CoVE重组质粒,并表达和纯化出His-CoVE目的蛋白,该蛋白分子量为56 KD,为研究猪δ冠状病毒E蛋白的免疫作用提供基础。2猪δ冠状病毒S1蛋白载体构建与表达本研究合成了pET21b-pSUMO-CoVS1质粒,经过SDS-PAGE电泳检测和灰度分析,pET21b-pSUMO-CoVS1所表达的目的蛋白可溶部分占比34%。为了促进目的蛋白的可溶性,利用载体重组的方法将CoVS1基因与八个可溶性标签相连构建了八个重组质粒:pET21b-6×His-Grifin-CoVS1、pET21b-6×His-GST-CoVS1、pET21b-6×His-MBP-CoVS1、pET21b-6×Hi s-SUMO-CoVS1、pET21b-6×His-Thioredoxin-CoVS1、pET21b-6×His-γ-crystallin-CoVS1、pE T21b-6×His-Ars C-CoVS1、pET21b-6×His-Ppi B-CoVS1。酶切鉴定结果表明成功构建了八个重组质粒,经过SDS-PAGE电泳检测和灰度分析,pET21b-6×His-MBP-CoVS1融合表达效果最好,目的蛋白可溶部分占比62%,与pET21b-pSUMO-CoVS1质粒相比融合蛋白可溶性提高1.8倍,并且成功纯化出MBP-CoVS1重组蛋白,MBP-CoVS1重组蛋白可用于下一步免疫试验。3猪δ冠状病毒E蛋白和S1蛋白免疫效果研究His-CoVE和MBP-CoVS1重组蛋白分别经过诱导表达和纯化后,与弗氏佐剂等体积混匀制备疫苗,每只1mg重组蛋白免疫新西兰兔。四免后一周采血分离血清,以Western-blot和ELISA方法检测免疫效果,以His-CoVE和MBP-CoVS1重组蛋白为抗原,分离的血清作为一抗,Western-blot结果表明His-CoVE和MBP-CoVS1在相应位置均有阳性条带;以猪δ冠状病毒CH-01包被抗原,分离的血清作为一抗,ELISA检测MBP-CoVS1组免疫后血清效价达到1:6400,His-CoVE组免疫后血清效价达到1:3200,均显著的高于对照组。本研究分离的血清可作为多克隆抗体用于PDCoV的诊断研究与中和试验,为PDCoV的诊断与预防提供理论基础和参考。