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Reticulocalbin3(Rcn3)是一种定位于内质网分泌途径的蛋白，可能参与蛋白的合成与分泌。蛋白序列比对发现Rcn3是CREC蛋白家族的成员，含有多个钙离子结合位点及内质网定位信号，但对其确切的生物学功能乃至整个CREC家族知之甚少。利用本实验室建立的Rcn3基因敲除小鼠模型研究发现，KO(Rcn3-/-)小鼠胚胎可以在母体内正常发育，但KO小鼠出生后因呼吸失败而在60min内窒息缺氧死亡。研究发现因为肺泡不能正常张开，肺泡Ⅱ型细胞发育异常。对E18.5时胎肺中Rcn3家族蛋白检测发现，Rcn3基因缺失时Rcn1和Rcn2的mRNA水平和蛋白水平无显著变化;并且敲除鼠的胎肺发育前期的支气管分支和肺毛细血管的形态建成不受影响。在E15.5时，Rcn3缺失后和野生鼠胎肺的发育并无显著差异。TENUL和Caspase-3蛋白水平检测，肺泡发育早期和后期Rcn3基因缺失不影响肺细胞的增殖和凋亡;在E18.5时期，胎肺中CCSP蛋白表达定位不受Rcn3蛋白缺失影响，Clara细胞发育正常。这是首次发现一个看家基因(Rcn3)的缺失能够导致哺乳动物肺呼吸失败。 电镜观察发现，KO胎鼠肺切片Ⅱ型肺泡上皮细胞胞质内的糖原颗粒显著增加，板层小体数目显著减少。在WT胎肺中，可以看到典型的紧密而规则的管状髓磷脂样结构，而KO胎鼠肺中则是不规则的管状髓磷脂样小泡。所以，Rcn3基因敲除破坏了糖原向磷脂的转化并影响板层小体对表面活性物质的装配。 对E18.5时期WT和KO肺脂质进行液相色谱-质谱检测，共检测分析了19类脂质中的319种脂质及其衍生物。检测结果显示，与WT胎肺相比，KO胎肺中总脂质(total lipid)水平显著降低，且总磷脂量和胆固醇(Cho)也显示出降低趋势。在肺泡表面活性物质中，磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)约占总磷脂量的80％，并且在板层小体上含有大量的带棕榈酸基团的磷脂酰胆碱。PC32∶0(16∶0-16∶0)，PC32∶1(16∶0-16∶1)和PC34∶1(16∶0-18∶1)是磷脂酰胆碱的主要组分，在KO胎肺中它们均显著降低，并且其它PC组分也显示出降低趋势。 KO胎鼠的肺表面活性蛋白Sp-A、Sp-D和Abca3显著降低，KO胎肺中脂质检测发现磷脂酰胆碱含量显著降低，并且胆固醇也明显低于野生胎肺的含量。因此推测Rcn3基因敲除导致胎鼠肺中表面活性物质分泌受到影响，进而影响板层小体装配，导致肺泡空间的脂质水平紊乱。 而在Rcn3-shRNA knockdown细胞模型中也发现，ELISA检测细胞分泌的表面活性物质，结果显示Sp-A、Sp-B、Sp-C和Sp-D蛋白显著降低，并且WesternBlot检测发现细胞内的Sp-A和Sp-D、Abca3蛋白水平和PC含量也显著降低。当用Eeyarestatin1抑制Rcn3-shRNA knockdown MLE-15细胞的ERAD通路时，可以恢复细胞的Sp-A、Sp-D和Abca3蛋白水平。 通过构建条件性敲除载体，获得嵌合鼠，并通过繁育获得Rcn3flox/flox转基因鼠，通过杂交获得可以在特定时间特异性敲除肺中Rcn3基因的转基因鼠Spc-rtTAtg/-/(TetO)7CMV-Cretg/-Rcn3flox/flox，为后续研究Ren3基因功能提供了良好的动物模型。 综上所述，发现Rcn3基因敲除导致肺泡在成熟过程中，表面活性物质分泌降低，板层小体数目减少，影响板层小体对表面活性物质的装配，进而影响肺泡中脂质分泌紊乱，导致胎鼠出生呼吸失败死亡。本课题为深入研究Rcn3基因和分子机制打下基础，并为新生儿呼吸窘迫综合征研究建立了动物模型和研究基础。