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一、Smads蛋白在TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中作用 目的：肺肌成纤维细胞在肺纤维化发生机制中起重要作用，其分化标志是α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表达。研究发现TGF-β1可通过Smads蛋白家族成员传递信号发挥生物作用，因此本研究主要探讨在TGF-β1诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化过程中，各Smad蛋白对α-SMA基因表达的调控作用。 方法： 1、体外培养人胚胎肺成纤维细胞（HFL-F），TGF-β1干预后通过Western blot及RT-PCR分析α-SMA基因mRNA和蛋白水平表达的变化，同时用免疫荧光法观察细胞形态改变。 2、构建含人α-SMA基因启动子序列的荧光素酶报告基因质粒（p895-Luc）和Smad2突变表达质粒(pSmad2mut)：以人基因组DNA为模板用PCR扩增人α-SMA基因启动子-895～+9bp序列，插入到pGal3-basic质粒的MluⅠ和XhoⅠ酶切位点之间形成p895-Luc。突变Smad2序列是通过以pCS2-Smad2质粒为模板用PCR方法获取，然后将其插入到经BglⅡ和XhoⅠ酶切后的pCS2-Smad2质粒片段形成pCS2-Smad2mut。Smad2、Smad3、Smad7和Smad3mut表达质粒为他人惠赠。 3、用Fugene6.0将p895-Luc分别和各种Smad表达质粒瞬时共转染至HFL-F中，TGF-β1干预后测定其荧光素酶和β—半乳糖苷酶的活性。 4、用Fugene6.0将各种Smad表达质粒瞬时转染至HFL-F中，TGF-β1干预后通过Western blot分析α-SMA基因的蛋白表达。 结果： 1、5ng／ml TGF-β1作用4天能诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。 2、过表达Smad3能增强TGF-β1诱导的α-SMA基因启动子活性和其蛋白表达，而过表达Smad3mut能抑制这种增强作用，但没有使其恢复到基础水平，两者对α-SMA基因的基础表达没有影响。 3、过表达Smad2和Smad2mut不影响TGF-β1对α-SMA基因启动子活性及蛋白表达的