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研究背景克罗恩病（Crohn’s disease,CD）发病率我国虽不及欧美国家,但近些年有明显上升趋势。其发病机制及迁延不愈、出现多种并发症原因迄今未明。国内外学者提出多种假说,并从遗传易感、免疫功能缺陷、肠道生态菌群失调、食物抗原刺激等方面对CD发病机制进行实验及临床研究,但这些结果不尽相同,尚无公认、重复性高的研究结果来充分证明克罗恩病发病机理。目前比较倾向于克罗恩病的发生是基因和环境因素共同作用的结果,多数为环境的改变导致基因突变,使得lncRNA、miRNA、circleRNA、sRNA等非编码RNA产生增多或减少,这些非编码基因,尤其是表达量最多的lncRNA,广泛参与表观遗传的调控,可能是导致肠上皮细胞产生持续的炎症反应。而关于lncRNA是否参与CD的发病研究目前国内外报道较少。研究目的高通量测序技术筛选出CD患者回肠末端异常肠黏膜组织,及健康体检者回肠末端正常组织差异lncRNA和mRNA表达;使用生物信息分析技术CNC预测差异表达的lncRNA的共表达mRNA基因。为探讨lncRNA在肠黏膜中的作用奠定基础。明确lncRNA定位在肠黏膜哪种细胞,细胞亚结构中定位。根据lncRNA在细胞中的定位,预测可能的调控机制如Ce机制或Cis/Trans。根据调控机制,关联分析构建lncRNA,mRNA共表达网络;使用miRBase/Target Scan预测中间调节因子miRNA,最终得到可能参与CD疾病变态炎症反应调控机制的lncRNA-miRNA-mRNA基因调控通路。在临床水平和细胞水平对预测出的lncRNA-miRNA-mRNA基因机制通路进行验证分析。在动物水平,证明干预lncRNA表达对动物生理状态、结肠病理损伤程度、相关免疫细胞比例等有明显改善。研究方法收集40例CD患者病变肠黏膜作为实验组及40例健康体检者正常肠黏膜（40:40）,并提取总RNA,并进一步纯化。每组随机抽取3例已提纯的样本的总RNA进行高通量测序,生物信息分析克罗恩病患者回肠末端异常肠黏膜组织,及健康体检者回肠末端正常组织差异lncRNA和mRNA表达;RNA以差异倍数大于或等于10,且P小于等于0.05为标准,筛选出病变肠黏膜组织和正常肠黏膜组织中的差异表达lncRNA和mRNA分子。利用Pearson相关系数法（CNC分析）预测差异表达的lncRNA的相关靶基因mRNA;针对差异性表达的lncRNA的靶基因,运用生物信息学方法,预测并分析差异lncRNA的共表达靶基因mRNA的中间是否存在调控因子。扩大样本量,使用CD肠黏膜病变和正常肠黏膜组织（40例:40例）的总RNA,进行qRT-PCR验证代表性具有差异表达的lncRNA,共表达基因mRNA,这些lncRNA和mRNA是否如测序分析结果一样,真正在肠黏膜组织中差异表达;使生物信息分析统计方法,寻找到明显差异表达的lncRNA和明显差异表达的mRNA相关性,根据mRNA进行GO（Gene Ontology）分析和Pathway分析预测其调控者的功能,为探讨lncRNA在肠黏膜中的作用奠定基础。本研究进一步选取差异最明显lncRNACNN3-206及共表达基因Caspase10作为研究目标。FISH实验确定lncRNACNN3-206主要分布于肠黏膜的上皮细胞、淋巴细胞、成纤细胞等哪种细胞中。并在高倍放大镜下观察其主要分布于细胞质还是细胞核。因为若位于胞浆主要通过Ce机制调控靶基因,若位于细胞核主要通过Cis/Trans机制调控靶基因。根据关联分析构建lncRNACNN3-206,mRNA（Caspase10）共表达网络;使用miRBase/Target Scan预测中间调节因子miRNA（miR212）。初步建立lncRNACNN3-206-miR212-Caspase10基因表达调控网。在细胞水平,阐明lncRNACNN3-206对靶基因Caspase10调控的具体分子机制,对肠黏膜的特定细胞有哪些生物学功能影响（细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移、细胞自噬等）。最后在动物水平,通过干预肠上皮细胞内lncRNACNN3-206的水平,观察CD模型动物生理状态、结肠黏膜病理损伤程度、血液循环中促进CD进展的相关免疫细胞比例等是否有明显改善。研究结果6个组织标本总的RNA基因测序筛查共检测出51388条lncRNA,共有400条lncRNA在CD患者病变组织和正常组织比较中存在显著差异（p<0.01）,其中有243条在病变的组织中表达上调明显超过对照组正常黏膜组,157条在阳性组织中表达下降明显超过对照组。将生学物信息分析预测到的上调和下调最显著的前10条lncRNA进行筛选及聚类分析,然后对差异表达Top5 lncRNA进行扩大临床组织标本验证,使用CD回肠末端病变和正常体检者回肠末端肠黏膜（40例:40例）进行RT-PCR验证,通过t检验对比分析证明在组织中差异表达情况,明确是否与基因测序结果一致。结果发现6条lncRNA与测序检测结果相符合,其中lncRNA ZNF292和lncRNACNN3-206差异最明显,由于ZNF293数据标准差大于lncRNACNN3-206,选择数据可信度较大的lncRNACNN3-206作为研究对象。FISH实验确定lncRNACNN3-206主要分布于肠上皮细胞的细胞质中,从细胞质内lncRNA的Ce机制出发,使用miRBase/Target Scan预测lncRNACNN3-206、Caspase10中间调节因子miRNA（miR212）。初步建立lncRNACNN3-206-miR-212-Caspase10基因表达调控网。在肠上皮细胞内,lncRNACNN3-206对Caspase10的调控是通过吸附miR212实现的,lncRNACNN3-206通过吸附大量miR212,减少细胞内游离miR212的浓度,从而抑制miR212对Caspase10沉默作用。最终结果是lncRNACNN3-206促进细胞内大量凋亡Caspase10产生。在细胞水平阐明lncRNA通过吸附miR-212调控靶基因Caspase10促进肠上皮细胞凋亡和迁移、自噬的分子机制,从根本上说明了CD患者肠道炎症不同于普通肠道炎症和溃疡性结肠炎表现,而是从肠道黏膜层迅速浸润到黏膜肌层、黏膜下层、浆膜层,容易形成透壁性肠壁炎症,从根本上揭示肠瘘是CD患者主要并发症的原因。最后在克罗恩病模型小鼠肠道内,干预肠黏膜lncRNACNN3-206的水平,观察治疗后模型小鼠较模型小鼠生理状态明显改善,结肠病理损伤程度明显减轻,相关免疫细胞比例接近正常。研究结论CD患者病变肠黏膜组织和健康体检者正常组织中lncRNA的种类和含量存在明显差异,说明病变组织中差异表达的lncRNA在肠黏膜炎症进展中发挥重要作用。lncRNACNN3-206通过lncRNACNN3-206-miR-212-Caspase10基因调控网激发肠上皮细胞的凋亡、迁移、自噬的生物学行为,对诱发CD发病和维持疾病的持续发展起着关键作用。因此lncRNACNN3-206完全可以作为研究CD治疗方案的新靶点,为人类基因治疗CD提供新的思路和研究方向。