论文部分内容阅读
炎症相关性皮肤病在皮肤科发病率占据半数以上,以银屑病、特应性皮炎等为代表。目前认为此类疾病是一种T淋巴细胞介导的免疫紊乱性皮肤病,与活化T淋巴细胞产生的Th1型细胞因子（以TNF-α、IFN-γ为代表）密切相关。T细胞和角质形成细胞分泌的细胞因子在炎症性皮肤病中形成复杂的细胞因子网络,导致其特有免疫病理损伤。核因子-kappa B（NF-κB）信号转导通路和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号转导通路异常与炎症反应关系密切,成为炎症性皮肤病发病机制及药物治疗靶点的研究热点之一。TNF-α和IFN-γ是皮肤炎症反应中重要的病理因子,可引起角质形成细胞内蛋白激酶的连锁反应,激活上述两通路,参与调控炎症反应的发生和发展。小檗碱系毛莨科黄连属植物黄连的根状茎中提取的主要有效成分,是传统的抗菌药物,有一定的抗炎等生物活性。盐酸13-己基小檗碱（HB-13）是盐酸小檗碱（BBR）的衍生物;巴马汀（黄藤素）来源于黄藤等多种植物,盐酸13-己基巴马汀（HP-13）是盐酸巴马汀的衍生物。HB-13和HP-13的结构非常类似。前期研究表明,两个化合物具有原代化合物（小檗碱和巴马汀）所不具备的、或强度超过原代化合物的生物活性,如抗菌、抗疱疹病毒和抗炎活性等。本研究以HB-13和HP-13为研究的目标化合物,用来源于人正常皮肤的角质形成细胞永生化株HaCaT细胞作为研究体系,探讨HB-13和HP-13对TNF-α和/或IFN-γ引起的HaCaT细胞NF-κB信号通路和p38MAPK信号通路活化的影响,并研究了两化合物对T淋巴细胞活化及对细胞因子表达功能的影响。研究内容与结果分为三个方面:第一章HB-13和HP-13对T淋巴细胞活化、对角质形成细胞IL-8表达及对小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β表达的影响通过体外培养小鼠脾细胞,用伴刀豆球蛋白A（ConA）作为刺激剂,用MTT法检测HB-13和HP-13对小鼠T淋巴细胞活化的影响;通过rhTNF-α诱导HaCaT细胞,用ELISA测定HB-13和HP-13对rhTNF-α上调的细胞IL-8表达水平的影响;通过LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞,用ELISA检测两者对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β表达的影响。结果显示,（1）HB-13在0.04875μg/ml～0.39μg/ml,HP-13在0.78μg/ml～3.12μg/ml浓度范围内抑制小鼠T淋巴细胞增殖,抑制率分别为12.7%-78.2%和14.3%-92.5%,抑制作用具有剂量依赖趋势,IC50值约为0.123μg/ml和1.563μg/ml;（2）HB-13和HP-13在0.39μg/ml～3.12μg/ml实验浓度范围内能明显降低经rhTNF-α上调的IL-8水平,IL-8表达抑制率约为85.7%-99.5%和68.4%-95.1%;（3）在0.01μg/ml～1μg/ml浓度范围内,HB-13对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β表达的抑制率超过50%,抑制作用有量-效趋势,IC50值约为0.013μg/ml。1μg/ml HP-13能明显抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β表达,抑制率超过90%。以上结果表明,HB-13和HP-13对T淋巴细胞活化及炎症性细胞因子IL-8和IL-1β表达有抑制作用。第二章HB-13和HP-13对人表皮角质形成细胞NF-κB信号转导途径的影响通过体外培养HaCaT细胞、外源性rhTNF-α或rhIFN-γ诱导细胞IκB-α蛋白磷酸化,利用免疫印迹法检测HB-13和HP-13对TNF-α或IFN-γ诱导的HaCaT细胞NF-κB活化的影响。结果显示,（1）HB-13和HP-13在0.39μg/ml～1.56μg/ml浓度范围内抑制rhTNF-α刺激引起的p-IκB-α表达,抑制率分别为47.4%-67.5%和32%-67.2%,抑制作用具有剂量依赖趋势,IC50值约为0.441μg/ml和0.832μg/ml。（2）HB-13和HP-13对rhIFN-γ刺激引起的p-IκB-α表达也有抑制作用,在0.39μg/ml～1.56μg/ml浓度范围内抑制率分别为37.8%-57.4%和37.5%-43.6%,抑制作用也呈一定的剂量依赖趋势,IC50值分别为0.923μg/ml和4.556μg/ml。以上结果表明,HB-13和HP-13对rhTNF-α和rhlFN-γ引起的HaCaT角质形成细胞NF-κB活化均有抑制作用。第三章HB-13和HP-13对人表皮角质形成细胞p38MAPK信号转导途径的影响通过体外培养HaCaT细胞,用外源性rhTNF-α作为刺激剂诱导细胞p38MAPK蛋白磷酸化,利用免疫印迹法检测HB-13和HP-13对TNF-α刺激的HaCaT细胞p38MAPK通路活化的影响。结果显示,HB-13和HP-13在0.39μg/ml～1.56μg/ml实验浓度范围内对rhTNF-α刺激引起的p-p38的表达均无明显抑制作用。以上结果表明,HB-13和HP-13对rhTNF-α引起的HaCaT角质形成细胞p38MAPK途径的活化无明显抑制作用。两化合物的抗炎作用可能与p38MAPK信号转导途径无关。