论文部分内容阅读
乙酰羟酸合成酶（AHAS）是一个广泛存在于植物和微生物体内诱导支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸合成的关键性酶。已经证实它为多种除草剂靶酶,如目前广泛使用的除草剂磺酰脲类和咪唑啉酮类。本研究从植物拟南芥叶片中克隆了乙酰羟酸合成酶催化亚基基因,用大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统表达了乙酰羟酸合成酶催化亚基,并研究了表达产物的活性被除草剂的抑制作用,并用荧光法研究乙酰羟酸合成酶与氯嘧磺隆、咪草烟和单嘧磺隆中间体的相互作用。主要研究结果如下:（1）从拟南芥叶片中提取总RNA,根据已报道的拟南芥AHAS序列（NM 114714）,利用RT-PCR技术扩增,获得了包含乙酰羟酸合成酶催化亚基基因的DNA片段（GenBank接受号:DQ991161）,此片段包含一个2013 bp的读码框（编码670个氨基酸）,与参考序列（NM 114714）比对,发现本研究所克隆的乙酰羟酸合成酶催化亚基基因序列与NM 114714的氨基酸序列同源性高达99%。（2）利用SalⅠ和NotⅠ位点,将本研究所克隆的拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基基因（去除前85个氨基酸的导肽序列）克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a（+）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,以融合形式进行蛋白表达。经SDS-PAGE分析表明,在69 KDa附近获得了预期的表达条带,且表达产物在大肠杆菌中以包涵体形式存在。（3）利用NotⅠ位点将本研究所克隆的拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基基因克隆入酵母表达载体pPIC9K,将经过PCR和酶切同时鉴定获得的正向连接重组子转化入酵母菌株GS115,筛选（Mut+）重组子并用甲醇诱导表达,获得了预期的AHAS表达条带（72 kDa左右）,表达产物以分泌形式表达。产物表达时相分析表明,在诱导72小时后表达量最高。（4）将利用大肠杆菌表达的拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基包涵体在变性条件下用镍柱纯化,再经稀释法复性,进行活性测定,测得酶活值为1.18×10-8μmol/min,酶比活值为1.31μmol /mg·min。将利用毕赤酵母表达的拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基进行粗酶活性测定,表明酶活值为1.11×10-8μmol/min,比活性为0.59μmol/mg·min。（5）利用荧光光谱法研究了溶液状态下乙酰羟酸合成酶与除草剂氯嘧磺隆（简称CE）、咪草烟（IQ）和农药单嘧磺隆中间体的相互作用。确定了乙酰羟酸合成酶的荧光峰,结果表明CE和IQ对AHAS静态荧光猝灭,推测CE、IQ与AHAS之间能够形成复合物,主要为疏水作用,37℃下的猝灭常数Kq分别为4.73×1012和1.16×1012,结合位点数分别为1.0649和1.3813,表明CE与AHAS 1:1结合,IQ与AHAS 1:1结合或1:2结合。根据F（o|¨）rster非辐射能量转移理论得到CE与AHAS之间的结合距离为0.2972 nm（37℃）,IQ与AHAS之间的结合距离为0.399 nm（37℃）而农药单嘧磺隆中间体不能与乙酰羟酸合成酶相互作用。