鸡IL-2基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:luo_yanjiang1980
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白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)主要是在促有丝分裂素或特异性抗原刺激下,由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的一种淋巴因子,是机体主要的T细胞生长因子之一。由于IL-2具有的重要免疫调节功能,IL-2一直是细胞因子研究中的热点之一。但与人和哺乳动物比较,鸡IL-2的研究相对来说比较滞后,利用体外表达技术研制重组鸡IL-2蛋白以及抗鸡IL-2的多克隆和单克隆抗体并以此作为工具进行鸡IL-2蛋白的生物学特性、免疫调节作用及其在比较免疫学中作用的研究具有重要的意义。 我们根据Sundick等发表的鸡IL-2基因的cDNA序列,在其编码区两侧设计一对引物,利用RT-PCR技术从活化的鸡脾淋巴细胞中扩增出长约600bp的鸡IL-2基因cDNA,并把它克隆到PUC18载体上。经酶切鉴定及DNA序列测定,该基因为鸡IL-2基因,其序列与Sundick等报道的完全一致。在此基础上,我们把鸡IL-2基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pPROEXTMHT中,构建重组表达质粒并进行确证性序列测定,重组质粒测序结果表明将编码鸡IL-2成熟蛋白的基因正确地插入到原核表达载体pPROEXTMHT的目的位点。重组质粒转化受体菌DH5α后用IPTG于37℃进行诱导培养,SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达的鸡IL-2融合蛋白分子量约为18kDa,表达的融合蛋白经薄层扫描发现目的蛋白表达量约占菌体蛋白的30%。包涵体被6M盐酸胍裂解后,用镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-2融合蛋白及其纯化产物免疫家兔,制备兔抗鸡IL-2多克隆抗血清,并用琼脂扩散实验对多克隆抗血清进行鉴定,表明其与标准的鸡IL-2蛋白具有良好的反应性。这为今后进一步进行鸡IL-2的生物活性研究及其应用奠定了基础。
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