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前言:胃癌是一种常见的恶性肿瘤,据有关文献报道,在我国其死亡率居各种恶性肿瘤之首。胃癌患者的主要死因为肿瘤病灶的侵袭及转移。因此探讨其侵袭转移机制显得尤为重要。在众多的促转移分子中,转化生长因子β(transforming growthfactor beta,TGFβ)是一重要分子,它参与了多种肿瘤的侵袭和转移过程。用基因转染的方法诱导肿瘤细胞中TGF-β1表达可增加肿瘤细胞的转移能力。同时有研究表明,阻止TGF-β信号通路可以抑制胃癌的转移。我们的早期研究发现TGF-β1可以促进胃癌细胞SGC7901和BGC823的浸润和转移。一些临床研究也显示:TGF-β1的表达与淋巴结的转移和预后不良呈正相关。目前虽然已有许多研究证实了TGF-β1在肿瘤侵袭和转移中的作用,但其具体机制尚不明确。研究表明TGF-β促浸润转移作用可由smad依赖通路及smad非依赖通路介导。TGF-β与细胞膜Ⅱ型受体(TβRⅡ)结合后,激活Ⅰ型受体,活化的Ⅰ型受体激活下游分子smad2和smad3,随后smad2/smad3与smad4结合形成smad复合物并转移到核内,调节TGF-β介导的靶基因转录。而在smad非依赖通路中,JNK,Erk和P38通路则被认为是关键性的通路。基于TGF-β在肿瘤发生与转移中的重要性,所以深入探讨TGF-β促转移机制具有非常重要的理论及临床意义。人类fascin 1基因属于fascin家族,其蛋白质编码产物是一种分子量为55 kDa的细胞骨架蛋白,可与F肌动蛋白结合,定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶(ruffles)边缘与细胞的运动、癌细胞的转移有密切关系的公状伪足、微棘(microspikes)的核心肌动蛋白束中。细胞内fascin 1基因表达上调引起细胞间连接发生解离,同时细胞的运动也相应增加。而将fascin 1基因转染至fascin 1基因低表达的结直肠癌细胞系SW 1222中,结果细胞膜表面突起增多,细胞分化程度降低,细胞运动性增强。Fascin蛋白在胃癌中表达明显增高,它的高表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期和复发密切相关。有研究表明在肺癌中TGF-β1可诱导fascin1基因表达上调,且TGF-β1和fascin1蛋白都与肺癌的侵袭与转移有关,但是目前TGF-β与fascin1在胃癌侵袭与转移中是否存在调控关系尚未见文献报道。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来发展起来的一种新技术,由于它能特异而有效地阻断靶基因的表达,目前被广泛应用于各种肿瘤的研究。我们构建了针对Fascin1的短发夹RNA(shortharpin RNA,shRNA)真核表达载体并首次转染人胃癌细胞MKN45,观察抑制fascin1表达前后,TGF-β1作用对胃癌侵袭和转移的影响,并对其机制作初步探讨。目的:研究TGF-β1对fascin1基因表达的影响,以及fascin1在TGF-β促胃癌侵袭与转移中的作用。探讨以fascin1为靶的胃癌基因治疗以及进一步揭示TGF-β1促胃癌侵袭和转移机制提供理论和实验依据。方法:1.通过细菌转化、质粒提取、酶切、凝胶电泳、基因测序鉴定和基因重组技术等方法构建针对Fascin1的RNAi质粒pGen-1-FSCN1和阴性对照质粒pGen-1-con。2.利用脂质体介导转染技术转染人胃癌细胞MKN45,经G418筛选得到稳定抑制fascin1表达的胃癌细胞模型(pGen-1-FSCN1细胞);分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blotting检测RNAi组(siFascin1)、对照组(CON)及未转染组(NT)三组细胞中Fascin1的表达。3.以10ng/ml的TGFβ1处理siFascin1,CON,NT三组胃癌细胞,观察处理前后各组细胞生物学行为的变化,采用MTT比色法测定细胞的黏附能力,Boyden小室测定法测定转染细胞的迁移能力和侵袭能力;腹腔移植法建立裸鼠胃癌细胞转移模型。4.分别瞬时转染smad2,smad4的siRNA(small interfering RNA),检测smad依赖通路在TGF-β诱导fascin1促胃癌浸润与转移中的作用;应用JNK,Erk和P38通路的特异性抑制剂检测smad非依赖通路在TGF-β诱导fascin1促胃癌浸润与转移中的作用。结果:1.TGF-β1(10ng/ml)在作用于MKN45细胞24小时后,fascin1基因表达约为0小时的2.2倍。2.限制性酶切及基因测序证实成功构建了针对fascin1基因的RNAi载体pGen-1-FSCN1。经G418筛选,RT-PCR及Western blotting鉴定,成功建立了稳定抑制fascin1基因表达的胃癌细胞模型。3.与CON和NT比较,siFascin1细胞的黏附能力、迁移能力、侵袭能力和转移能力明显降低(p＜0.05);三组细胞经TGF-β1(10ng/ml)预处理后,其中CON与NT细胞黏附能力、迁移能力、侵袭能力和转移能力明显增高(p＜0.05);而在siFascin1组,TGF-β1处理前后细胞黏附能力、迁移能力、侵袭能力和转移能力无明显变化(p＞0.05)。4.分别瞬时转染smad2,smad4的siRNA于MKN45细胞中,予TGF-β1处理后,经western blotting检测发现,MKN45中smad2,smad4的表达水平较未转染前减少约70%,而在干扰smad2,smad4后,MKN45细胞中的fascin1表达无明显变化;选用JNK,Erk和P38通路的特异性抑制剂,SP600125,PD98095和SB203580分别预孵育MKN45细胞1h,结果发现:SP600125和PD98095组予TGF-β1处理24小时后,fascin1的表达明显降低(p＜0.05),而P38通路的特异性抑制剂SB203580对fascin1的表达无明显影响。结论:1.首次证实,在胃癌细胞MKN45中fascin1基因表达受外源性TGF-β1(10ng/ml)调控。2.成功构建了针对fascin1基因的RNAi质粒pGen-1-FSCN1,建立了稳定抑制fascin1基因表达的胃癌细胞模型。3.稳定抑制fascin1基因表达后,TGF-β1促胃癌细胞侵袭和转移能力下降。4.TGF-β1主要通过JNK和Erk通路诱导fascin1基因促进胃癌的侵袭和转移。