研究背景和目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是指原发于从盲肠到直肠区间的消化道恶性肿瘤,是全球范围内导致癌症死亡的主要疾病之一。据统计,超过半数（约55%）的结直肠癌发生在发达国家,但是随着发展中国家（主要是中国、巴西和印度）经济的发展和生活方式的西化,结直肠癌的发病率也在逐年上升,因此在诊断和治疗方面亟待突破。早期诊断方面,目前早诊方法多种多样,但均未在敏感性和特异性间找到最大平衡点,寻找理想的早诊方法是结直肠癌防治研究中的重要内容之一;治疗方面,尤以免疫治疗已经成为根治肿瘤的希望所在,针对肿瘤特异及非特异免疫细胞治疗及分子靶向治疗方兴未艾,但仍需从机制到疗效的验证和研究。上世纪90年代,Bufill率先提出结直肠癌不应视为同一种疾病,是因为不同部位的结直肠癌在肿瘤生物学和临床方面存在诸多差异。Bufill以及后来的研究均以结肠脾曲为界,将结直肠分为右半结肠（盲肠到横结肠段）和左半结直肠（结肠脾区到直肠段）。多项多中心临床研究也表明:肿瘤原发部位对患者预后及治疗转归等存在显著影响,即原发于左右半结直肠肿瘤的预后明显不同,接受西妥昔单抗和贝伐珠单抗的治疗反应也明显不同,而其机制仍不清楚。基于以上现状,结合免疫治疗药物的免疫调控作用,本研究提出如下研究设想:希望从肿瘤免疫微环境的角度出发,利用公共大数据对左右半结直肠癌免疫特征进行描述及比较,同时使用临床标本对分析所取得的结果进行验证,从而从肿瘤免疫的角度完善对左右半结肠癌异质性的理解,并提示其预后和治疗反应不同的可能机制。据此,我们拟采用如下研究方法:研究方法:1.整体分析结直肠癌的免疫特征,对比两侧结直肠癌的免疫微环境。为了从整体视角来审视结直肠癌的免疫谱特征,本部分针对TCGA数据库中638例结直肠癌样本经标准化处理的RNA表达谱数据、原发部位、临床TNM分期、TP53/KRAS/BRAF/EGFR基因突变状况及随访信息等进行深度分析,参考文献的方法对微环境种27种免疫细胞基因簇采用聚类分析和相关性分析等方法对数据进行分析统计。然后按照免疫细胞浸润的程度,将结直肠癌分为高、中、低浸润三类,并比较三类之间的差异。最后为进一步明晰左右半结直肠癌的异质性,我们按部位（左和右）详细评估左右结直肠癌的免疫微环境。2.着眼左半结直肠癌对西妥昔单抗反应良好的现象,分析背后的免疫机制。多项多中心临床研究显示,左半结直肠癌应用西妥昔单抗治疗比贝伐珠单抗治疗带来的生存获益更明显。那么左半结直肠癌背后有什么免疫机制影响临床疗效啦?针对这样的临床问题,我们继续深入寻找背后的免疫机制。具体方法是:采用深度生物信息学分析的方法,如单样品基因集富集分析（Single-Sample Gene Set Enrichment Analysis,ssGSEA）寻找在左半结直肠癌中影响患者最终结局的关键因素,同时行KEGG pathway注释分析寻找有别于右半结肠癌的免疫特点。3.着重分析右半结肠癌对贝伐珠单抗反应良好的原因,并通过临床标本验证。有研究表明,右半结肠癌在贝伐珠单抗治疗带来的生存获益更加明显。为了进一步明确该现象背后的机制,我们通过相关性分析,寻找右半结肠癌免疫相关的因素。前提是这种差异不在左半结直肠癌中起主导作用,以期寻找到能明显提示右半结肠癌治疗结局的相关指标。在数据分析的基础上,我们使用临床标本对我们获得的分析结果进行验证。通过组织芯片免疫组化染色的方法,对90例病人的癌灶和癌旁组织进行分析,探讨免疫相关因素在肿瘤真实世界中所起的作用。研究结果:1.综观结直肠癌的免疫微环境,左右半结直肠癌各具特异性免疫微环境。采用单样品基因集富集方法,根据文献报道的27种免疫细胞RNA表达谱特征计算其在肿瘤组织中的浸润程度,并依此将638例样本按免疫细胞浸润程度的高低划分为免疫高浸润（H,n=214）、中浸润（M,n=261）和低浸润（L,n=163）三组。同时系统性描述了免疫细胞浸润程度与免疫应答指标,包括细胞毒活性评分（cytotoxic activity scores,CYT）和IFN-γ的相关性,发现CYT和IFN-γ与免疫浸润明显呈正相关。我们进一步比较左右半结直肠癌之间免疫浸润和免疫活性的差异。发现,右侧结肠癌免疫细胞浸润程度明显高于左侧（H=81;M=82;L=36 vs H=102;M=160;L=97,p=0.0052）。在对T细胞功能的影响上,包括细胞毒活性评分CYT（p=7.73e-6）、抗原呈递相关分子（p=4.16e-5）、T细胞浸润评分TIS（p=6.942e-10）、γ干扰素标志（p=0.0004）和CD8 T细胞/Treg细胞比值（p=7.51e-11）在内均表现为右侧强于左侧,提示右半结肠癌可能具有更强的T细胞抗瘤免疫活性。2.左半结直肠癌有更高数量的CD56^bright NK。我们的结果提示,与右侧结肠癌相比,左半结肠癌中CD56^bright NK细胞数量上调（p=0.012）同时升高的CD56^bright NK细胞数量与左半结肠癌患者生存率正相关。且4-1BB信号通路（左侧:p=0.000424;右侧:p=0.428）、α干扰素通路（左侧:p=0.000973;右侧:p=0.594）激活均只在左侧患者中表现为预后良好。也就是说CD56^bright NK,特异的在左半结肠癌中对结直肠癌的结局有显著影响。3.右半结肠癌中VEGFA阻滞T细胞浸润和功能。右半结肠癌在使用贝伐珠单抗后生存获益明显。我们的结果表明,与左半结肠癌相比,VEGFA在右半结肠癌中与CD8⁺T细胞浸润（右侧:r=-0.267,p=0.0001;左侧:r=-0.115,p=0.029）,Th1细胞数量（右侧:r=-0.239,p=0.0007;左侧:r=-0.111,p=0.034）及效应分子穿孔素PRF1表达（右侧:r=-0.187,p=0.007;左侧:r=-0.02,p=0.702）相关性更强。同时经免疫组织芯片验证,我们也发现升高的VEGFA阻滞T细胞的浸润和功能,VEGFA升高会降低患者的生存预后。研究结论:1.左右半结直肠癌各具特异性免疫微环境,可能是是个体预后差异和治疗反应不同的免疫学基础。2.结合西妥昔单抗介导ADCC效应,提示CD56^brightNK细胞既可作为左半结直肠癌的免疫标志物用于预测患者的预后,又可解释西妥昔单抗反应良好的机制用于预测患者免疫治疗的应答情况。3.VEGFA阻滞CD8⁺T细胞的浸润和功能,VEGFA联合CD8a既可作为右半结肠癌的免疫标志物用于预测患者的预后,又可以解释贝伐珠单抗反应良好的机制用于预测患者免疫治疗的应答情况。