牦牛血抗氧化肽的抗缺氧作用及其作用机制研究

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lingqinhui47
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牦牛是散布在海拔3000 m以上的珍稀家畜,经过世代的自然选择,牦牛显示出对低氧环境极好的适应性,能适应一般家畜不能适应的高海拔、低气压、高缺氧等恶劣的生态环境,从而使牦牛的全身(毛、皮、血、肉、乳、内脏、骨、角)都有深度开发价值。本实验的前期研究已制备出具有体外抗氧化活性的牦牛血抗氧化肽,然而对于牦牛血抗氧化肽的抗缺氧作用及其作用机制方面的研究尚未见报道。因此,本实验在前期研究的基础上简化牦牛血抗氧化肽的制备工艺,对其氨基酸组成、肽段序列、物理化学稳定性(热稳定性、酸碱稳定性、金属离子稳定性、冻融稳定性以及对食品辅料的稳定性)进行研究;并通过动物实验进一步研究牦牛血抗氧化肽的体内抗氧化活性。在明确了牦牛血抗氧化肽抗氧化作用的基础上,研究牦牛血抗氧化肽的新适应症——抗缺氧作用。建立心肌细胞H9c2物理缺氧模型,研究牦牛血抗氧化肽保护缺氧心肌细胞的作用及其作用机制;建立小鼠常压缺氧模型,研究牦牛血抗氧化肽对缺氧小鼠的保护作用及其作用机制。主要研究结果如下:1.1 kDa超滤分级制备的牦牛血抗氧化肽对·OH的清除能力与Sephadex G-25分离纯化制备的峰Ⅰ组分相当(P>0.05);·OH清除能力、DPPH·清除能力、总抗氧化力以及脂质过氧化抑制能力均极显著优于商品大豆肽(P<0.01);·OH清除能力、DPPH·清除能力、总抗氧化力均极显著优于商品鱼胶原肽(P<0.01);牦牛血蛋白质水解得到的低聚肽是其抗氧化活性的主要来源。对分子量<5 kDa牦牛血抗氧化肽进行LC-MS/MS检测,定性及非标记定量到1159条肽段。2.牦牛血抗氧化肽(分子量<1 kDa)在2060℃时对·OH清除活性比较稳定。在弱酸以及碱性条件下,牦牛血抗氧化肽对·OH清除活性比较稳定。牦牛血抗氧化肽对·OH清除活性随冻融处理次数增多而降低。高浓度的Zn2+、Cu2+会抑制牦牛血抗氧化肽对·OH的清除活性。NaCl有助于提高牦牛血抗氧化肽对·OH的清除活性。葡萄糖、柠檬酸显著抑制牦牛血抗氧化肽对·OH的清除活性(P<0.05)。3.牦牛血抗氧化肽抗氧化活性的动物实验研究结果显示,牦牛血抗氧化肽能够提高小鼠血清T-AOC能力、GSH-PX活性和SOD活性,差异显著(P<0.05);降低小鼠血清中MDA含量,但不具备统计学意义(P>0.05)。此结果表明牦牛血抗氧化肽具有良好的体内抗氧化活性。4.牦牛血抗氧化肽保护心肌细胞H9c2缺氧损伤的实验结果表明,缺氧组较对照组的细胞存活率显著降低(P<0.01)、细胞凋亡率显著升高(P<0.01)、LDH释放水平显著升高(P<0.01),表明缺氧对H9c2心肌细胞产生了显著损伤。与缺氧组比较,牦牛血抗氧化肽干预能够提高缺氧细胞存活率,降低细胞凋亡率以及细胞中LDH的释放水平,并呈现良好的剂量依赖关系;同时,牦牛血抗氧化肽能够抑制线粒体膜电位下降,提高细胞T-AOC水平,降低TNF-α水平,抑制缺氧介导的细胞色素C的释放,上调抗凋亡蛋白(Survivin、p-Akt、Akt)的表达,降低促凋亡蛋白(Caspase-3/9)的活性,且牦牛血抗氧化肽也影响编码上述蛋白的mRNA水平。以上结果提示:牦牛血抗氧化肽对H9c2心肌细胞的保护与抑制PI3K-Akt信号传导通路、保护细胞线粒体结构功能完整性有密切关系。5.小鼠常压耐缺氧实验结果显示,不同剂量的牦牛血抗氧化肽对小鼠缺氧耐受力均有不同程度的提高作用,并呈现剂量依赖性,其中高剂量组能显著延长常压缺氧小鼠的存活时间(P<0.05);牦牛血抗氧化肽各剂量组均能延长小鼠亚硝酸钠中毒存活的时间,高、中剂量组的延长率极显著(P<0.01)。与对照组比较,采用高剂量牦牛血抗氧化肽干预能够极显著降低常压缺氧小鼠脑和心肌组织中MDA含量(P<0.01)、H2O2含量(P<0.01)、LDH活性(P<0.01),显著提高常压缺氧小鼠脑和心肌组织中SOD活性(P<0.01)、GSH-Px活性(心肌组织中P<0.01,脑组织中P<0.05)、CAT活性(P<0.01),极显著提高常压缺氧小鼠脑和心肌组织中ATP含量(P<0.01)。以上结果提示:牦牛血抗氧化肽能够缓解缺氧对机体导致的氧化应激损伤,作用机制与清除自由基、抑制脂质过氧化、维持机体抗氧化酶系活性以及维持线粒体内氧化磷酸化的正常进行有关。
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