论文部分内容阅读
第一部分内皮祖细胞的提取、培养、鉴定及细胞因子鉴定目的:观察内皮祖细胞的体外提取、培养、鉴定及内皮祖细胞分泌因子鉴定。方法:1.提取大鼠胫骨、股骨骨髓收集单个核细胞,连续培养14天,观察细胞生长情况,绘制细胞生长曲线图。2.采用FITC标记的抗大鼠CD133,PE标记的抗大鼠CD34加入细胞培养液,用流式细胞仪测定,并与同样加入两种同型抗体的空白对照组细胞对比。3.采用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1加入细胞培养液加入细胞培养液在激光共聚焦显微镜下观察、拍照,并与同样加入两种同型抗体的空白对照组细胞对比。4.使用ELISA试剂盒测定于培养第14天时间点,细胞培养液中血管内皮生长因子(VEGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子(IGF)含量。结果:体外培养的大鼠内皮祖细胞生长增殖旺盛,生物学性能稳定。采用流式细胞学、双荧光染色可检测到体外培养的表型特征典型的内皮祖细胞,VEGF、BDNF、IGF均在细胞培养液种检测到,其含量随培养时间增加而增多。结论:EPCs在体外稳定的提取、培养和鉴定,可为其在动物实验研究中提供最佳的移植浓度,同时也为EPCs的移植研究奠定了基础。EPCs自身可以分泌多种含有诱发血管新生和营养神经作用的细胞因子。第二部分高压氧干预对脊髓损伤大鼠巨噬细胞活化和神经保护的影响目的:观测高压氧干预对大鼠SCI后2种巨噬细胞亚型数量变化和神经保护作用。方法:将空白对照的正常大鼠脊SCI模型建立成功的10只大鼠,分成3组。1)空白对照组(n=5)。2)常压空气干预SCI大鼠组(NBA,1ATA下21%氧气,n=5)。3)高压氧干预(HBO)SCI大鼠组(2.8ATA下100%氧气,n=5)。高压氧干预后7天、第14天、第28天三个时间检测点对三组实验大鼠进行BBB评分检测;用免疫组化的方法测定三组实验大鼠脊髓中M1/M2亚型巨噬细胞含量;用勒克斯坚牢蓝(LFB)染色来测定三组实验大鼠第7天、第14天包绕神经轴突外的髓鞘情况。结果:HBO促进了M2型巨噬细胞的形成,HBO干预明显提高了髓鞘含量,受试大鼠的下肢功能评分明显改善。有助于大鼠脊髓损伤后的功能恢复结论:高压氧干预能促进大鼠肢体运动机能的恢复,尤其是促进后肢运动机能的恢复。第三部分内皮祖细胞移植联合高压氧对大鼠脊髓损伤修复机制研究目的:观察内皮祖细胞移植联合高压氧干预对大鼠脊髓损伤区组织修复血管再生及后肢功能的影响及分子生物学机制。方法:选取脊髓受损模型建立成功的28只成年雌性SD大鼠,分成4组,每组7只。1)SCI组造模成功后无任何干预措施。2)脊髓损伤+内皮祖细胞组(SCI+EPCs组),造模成功后于脊髓损伤部位注射EPCs。3)脊髓损伤+高压氧组(SCI+HBO组):SCI大鼠予以高压氧干预。4)联合组(SCI+EPCs+HBO组):SCI大鼠损伤局部注射EPCs后,采用高压氧干预。各自于移植前、移植后1天、3天、1周、2周、3周、4周通过BBB评分进行运动功能评定。移植后4周,TUNEL法测定各实验组大鼠SCI部位神经细胞的凋亡状况,通过HE染色观测SCI部位病理组织形态学变化,以RT-PCR、Western blot法检测脊髓损伤区及周围组织MMP9/2、突触素(Synaptophysin,Syn)基因和蛋白的表达的表达变化情况。结果:移植后(即细胞移植后)1周起,大鼠后肢运动机能评分(BBB评分)联合组优于SCI+EPCs组及SCI+HBO组,SCI+EPCs组及SCI+HBO高于SCI组,且每组均有显著的统计学差异(P<0.05);TUNEL凋亡细胞数值:联合组最低,SCI+EPCs组及SCI+HBO组第二,SCI组最高,每组均有显著的统计学差异(P<0.05)。HE染色后观察到联合组脊髓损伤区组织恢复程度较SCI+HBO组及SCI+EPCs组明显改善。MMP9/2及TGF-β1基因和蛋白表达:联合组最低,SCI+EPCs组及SCI+HBO组第二,SCI组最高,每组均有显著的统计学差异(P<0.05)。突触素(Synaptophysin,Syn)基因和蛋白表达:联合组较高,SCI+EPCs组及SCI+HBO组第二,SCI组最高,每组均有显著的统计学差异(P<0.05)。结论:高压氧干预对脊髓损伤起到神经保护的作用,内皮祖细胞移植的同时联合高压氧干预能够促进脊髓损伤大鼠神经功能修复及轴突再生,改善其大鼠肢体运动功能,其机制可能与升高损伤区突触素(Synaptophysin,Syn)表达及降低脊髓损伤区MMP9/2基因和蛋白表达有关。