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转录因子FOXO1,具有能量代谢等多种生物学功能。FOXO1通过其DNA结合结构域与启动子互作,调控靶基因的活性,从而发挥其生物学功能。实验室前期发现缺失DNA结合结构域的FOXO1（FOXO1ΔDBD）的存在对野生型FOXO1的功能具有抑制作用,并影响了动物的代谢水平,但其作用的分子机制不明。本论文从分子生物学、细胞生物学和动物生理学等方面,开展了一系列的研究。1、首先对FoxO1ΔDBD的转基因小鼠进行了表型分析,结果发现,转基因小鼠血浆瘦素（leptin）、去甲肾上腺素（norepinephrine）含量显著低于野生型小鼠（P＜0.05）,但肾上腺素（epinephrine）无显著差异。棕色脂肪组织（BAT）中2型碘甲腺原氨酸脱碘酶（DIO2）基因、解偶联蛋白1（UCP1）基因以及脂分解代谢相关基因长链酰基辅酶A脱氢酶（LCAD）和脂肪酸β氧化限速酶乙酰辅酶A羧化酶β（ACC2）基因转录水平显著高于野生型小鼠（P＜0.05）,而脂合成代谢相关基因脂肪酸合成酶（FASN）、二酰甘油酰基转移酶（DGAT1）和甲状腺激素应答蛋白（Thrsp）的表达差异不显著。为了检测BAT的产热功能,分别对野生型和转基因动物进行了冷刺激实验,结果显示:4℃冷刺激8 h时,BAT中甘油三酯（TG）含量和脂滴大小显著大于野生型小鼠（P＜0.05）;dio2表达水平依然显著高于野生型小鼠（P＜0.05）,而ucp1与野生型小鼠相比差异不显著,脂合成代谢相关基因FASN、DGAT1和Thrsp显著低于野生型小鼠（P＜0.05）,脂分解代谢相关基因ACC2转录水平显著低于野生型小鼠（P＜0.05）;转基因小鼠血浆中游离的三碘甲状腺原氨酸（T3）和四碘甲状腺原氨酸（T4）含量显著高于野生型小鼠（P＜0.05）。结果表明,转基因小鼠甲状腺激素的生物学作用和BAT中脂肪分解代谢增强,与前期发现的转基因小鼠能量消耗增加的结果相符。小鼠的能量消耗与BAT中线粒体呼吸链上的氧化磷酸化密切相关,FoxO1ΔDBD转基因小鼠BAT中ucp1表达升高导致氧化磷酸化的解偶联作用增强,促进产热,是增加能量消耗的重要原因之一。甲状腺激素T3能促进ucp1的表达,而DIO2的功能是催化T4脱碘转化为具有生物活性的T3,说明DIO2是间接调控UCP1作用的重要因子。为此,本论文又着重进行了转基因FoxO1ΔDBD对dio2基因启动子的调控研究,结果如下:2、FOXO1ΔDBD干扰FOXO1与dio2启动子的结合。通过生物信息学分析预测FOXO1与dio2启动子上潜在的结合位点,划分为6个区域,合成相应的6对PCR引物;选取F14代16周龄野生型与转基因小鼠各4只,超声破碎交联后BAT中的染色质进行免疫共沉淀（Ch IP）实验。结果表明:在dio2转录起始位点-635～-444 bp（区域2）与-1251～-1051 bp（区域5）两处区域,FOXO1的结合强度在转基因小鼠中显著低于野生型小鼠（P＜0.05）。3、区域2和区域5的缺失对dio2启动子活性的影响。从小鼠肝脏中提取基因组DNA,利用基因重组技术克隆了dio2转录起始位点-1628～+100的DNA序列,组装在p GL3-basic中,构成12个含有不同启动子截短体的荧光素酶报告基因检测载体,DNA测序结果表明各种载体构建成功;转染Hek293细胞后:-479～-30bp缺失使启动子活性减少了90%（P＜0.05）。为了验证区域2和区域5对dio2启动子活性的影响,将同时缺失或分别缺失两个区域的启动子进行了活性检测,结果显示,同时缺失两个区域的启动子活性显著下降了40%（P＜0.05）。过表达FOXO1对该启动子活性没有显著影响,说明FOXO1对dio2启动子的调控作用依赖这两个区域;而过表达FOXO1ΔDBD使其活性显著上调了30%（P＜0.05）,说明FOXO1ΔDBD可以通过其他的方式影响启动子活性。4、FOXO1ΔDBD影响FOXO1的细胞核定位。在Hek293细胞中过表达FOXO1及FOXO1ΔDBD,通过Western Blot检测相对含量、荧光共聚焦显微镜观察免疫荧光,分析FOXO1与FOXO1ΔDBD的细胞核定位。两种实验结果都表明,FOXO1在血清的刺激下出核,而添加FOXO1ΔDBD后,FOXO1的出核作用减弱,说明FOXO1ΔDBD影响了FOXO1的核定位。5、药物存在或不存在的情况下FOXO1ΔDBD对dio2启动子活性的影响。磨粉溶解或高温浸提得到不同中药提取物加入到细胞培养液中,将全长的dio2启动子（-1628～+100）转染至Hek293细胞后,在过表达的FOXO1与FOXO1ΔDBD存在或不存在时,检测dio2启动子活性。结果表明:盐酸小檗碱、黄连、黄芩对dio2启动子活性有促进作用;即使在上述药物存在的条件下,过表达FOXO1抑制dio2启动子活性（P＜0.05）,而FOXO1ΔDBD有显著的促进作用（P＜0.05）。结论:FOXO1ΔDBD可显著上调小鼠BAT中ucp1和dio2的表达,提高T3的血液水平,并抑制脂肪合成同时增加脂肪分解的作用,说明转基因通过甲状腺激素途径和脂代谢途径促进了小鼠的能量消耗;FOXO1ΔDBD的存在显著降低了BAT中FOXO1与dio2启动子上的两处区域的结合作用,从而解除FOXO1对dio2的抑制作用,这一结果在细胞水平上得到了验证;截短实验证明,-479～-30bp区域是dio2启动子活性所必需的,同时,区域2和区域5是FOXO1调控dio2启动子活性的关键区域;FOXO1ΔDBD会影响FOXO1的核定位,可能影响了FOXO1的功能;盐酸小檗碱、黄连、黄芩可显著提高dio2启动子活性,在这些药物存在的情况下,FOXO1对dio2启动子的抑制作用与FOXO1ΔDBD的促进作用依然存在。总之,本论文在细胞水平上研究了FOXO1ΔDBD对dio2启动子活性的调控乃至动物能量代谢的作用机制,将为能量代谢研究领域和代谢疾病研究方向提供参考。