【摘 要】
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已有研究表明镉(>20μM)可诱导人肝肾细胞凋亡,但是,镉能否诱导人肝肾细胞自噬目前还不是很清楚。本研究旨在分析镉诱导HEK293和WRL68细胞的自噬,及自噬与凋亡的关系。本研究
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已有研究表明镉(>20μM)可诱导人肝肾细胞凋亡,但是,镉能否诱导人肝肾细胞自噬目前还不是很清楚。本研究旨在分析镉诱导HEK293和WRL68细胞的自噬,及自噬与凋亡的关系。本研究分为三部分：1.构建pcDNA3.1-GFP-LC3B重组质粒,为建立快速检测细胞自噬的方法打下基础；2.探究镉(0～10μM)能否引起HEK293和WRL68胞自噬；3.探究HEK293细胞自噬与凋亡的关系。本实验运用细胞培养、基因重组及基因转染、Western blot、流式细胞术、显微及超微结构观察等细胞分子生物学技术,构建了pcDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体。检测了镉(0～10μM)诱导人肝肾细胞的自噬标志基因LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达；初步探究了自噬过程中ERK1/2和AKT的作用。用流式细胞术检测了镉(0～-10μM)诱导HEK293细胞的凋亡。探究了自噬抑制剂3-MA对自噬与凋亡的影响,并分析了自噬与凋亡的关系；观察了极低浓度镉(0～2.0μM)长时间40d处理HEK293后细胞形态变化情况,以分析自噬与和转化的关系。实验结果如下：1.通过PCR扩增出LC3B基因,与pcDNA3.1-GFP载体相连,成功构建了pcDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体,且能在HEK293和WRL68细胞中成功表达。2.低浓度镉(0～10μM)处理HEK293和WRL68细胞,均可引起细胞自噬,表现为LC3B-Ⅱ表达量增加、荧光显微镜下转染细胞出现绿色荧光点状聚集、透射电镜下观察到自噬泡。3.低浓度镉(0～10μM)处理HEK293细胞后,ERK1/2和AKT被激活。流式细胞仪也检测出自噬镉浓度下同时发生细胞凋亡；加入自噬抑制剂3-MA后,Cleaved Caspase-3的表达量增加。本研究表明了,低浓度镉(0-10gM)能诱导HEK293细胞自噬,且自噬与凋亡相伴发生；加入自噬抑制剂后,自噬减弱,凋亡增强；ERK1/2和AKT可能介导细胞自噬。
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