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家蚕微粒子病每年给我国蚕业生产造成高达上千万元的经济损失,其病原为家蚕微孢子虫(Nosema bombycis),对家蚕致死率极高。做好家蚕微粒子病防控是目前蚕病防治的重要任务之一。研究家蚕微孢子虫的致病机理可以为微粒子病的防控提供新的思路。Serpin是一类具有Serpin结构域的蛋白的统称,主要作为血液的蛋白酶抑制剂存在,也有很多的Serpin不具有抑制功能而作为贮存蛋白和能量转运相关蛋白。Serpin在医学和免疫学领域具有重要的研究价值。家蚕微孢子虫编码4479个基因中,包含一簇丝氨酸蛋白酶抑制物基因(Serpins),分析发现该基因只存在于Nosema属的微孢子虫中。家蚕微孢子虫基因组中有19条Serpins,其在微孢子虫侵染和增殖中扮演的生物学功能的还不清楚,有待深入的研究。本研究首次用杆状病毒表达的方式表达纯化得到真核表达的家蚕微孢子虫蛋白rNbSerpin6、rNbSerpin13和去信号肽的r△NbSerpin13,并获得了对胰蛋白酶具有抑制活性(△)NbSerpin13。1.Sf21细胞驯化和重组杆粒构建Sf21细胞是半贴壁细胞,使用无血清的SFM900Ⅱ培养Sf21细胞。优化培养条件,建立悬浮细胞系,最适条件是：28℃、120r/min条件下培养Sf21悬浮细胞,细胞密度达到4×106个/mL时进行细胞传代。同时,将(A)NbSerpinl3和NbSerpin6基因构建至pFastBacHTb供体载体中,得到pFastBac-NbSerpins质粒,利用穿梭载体转入大肠杆菌DH10感受态细胞中,通过转座酶的作用重组到杆粒上。通过蓝白斑和三抗筛选获得可靠性高于99%的重组菌株。大量培养筛选出的重组细菌,提取转染级杆粒。2. NbSerpin6和NbSerpinl3的杆状病毒表达与蛋白纯化将制备好的转染级的杆粒,在六孔细胞板中按1μg/孔重组杆粒rB acmid-NbSerpins转染Sf21细胞。转染96h后收集P1代病毒,在25cm2细胞培养瓶中接入适量P1代病毒,72h后收集P2代感染病毒,六孔板中测定P2代病毒滴度,P2代病毒按感染复数MOI=6接种到250mL细胞摇瓶中悬浮培养。感染3d后检测蛋白表达情况。确定感染情况后分别收集细胞沉淀和P3代病毒上清。将P3代病毒分别接种适量于500mL的细胞摇瓶进行悬浮细胞大量培养。培养60h后收集细胞沉淀,超声破碎,过滤,用His-亲和层析的方法进行蛋白纯化并脱盐、浓缩。得到纯化的NbSerpin6和(△)NbSerpin13蛋白,SDS-PAGE和Western bloting检测证实我们获得了重组蛋白。3. NbSerpins对蛋白酶的活性研究用纯化的NbSerpins蛋白作为抑制物,以商业化的胰蛋白酶和蛋白酶K作为抑制底物,酪蛋白作为蛋白酶的蛋白底物,苯甲基磺酰氟(PMSF)为抑制物阳性对照,不加抑制剂的组作为阴性对照,分别测定抑制效率。结果为：(△) NbSerpin13对胰蛋白酶具有极显著的抑制活性,对蛋白酶K不具有抑制活性。NbSerpin13对胰蛋白酶的抑制活性比值(相对PMSF)为0.41,△NbSerpin13的抑制比值(相对PMSF)为0.51。NbSerpin6对胰蛋白酶和蛋白酶K均不具有抑制活性。