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研究背景
子宫内膜癌(Endometrial Cancer，EC)是全球最常见的妇科恶性肿瘤之一，占女性恶性肿瘤总数的7％，约占女性生殖系统恶性肿瘤的20％-30％。据估计，2021年美国新发子宫体肿瘤病例数为66570例，预计死亡人数12940例[1]。此外，EC的发病率和死亡率在过去十年中稳步上升。目前，EC在临床上主要是根据国际妇产科联合会(Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期、肿瘤组织学分级和组织学类型进行风险分层。需要注意的是，具有相似临床病理特征的EC患者常出现不同的疾病结局，影响肿瘤侵袭和转移的分子表型的差异可能是导致这一现象的重要原因之一[2]。
核仁蛋白(Nucleolin，NCL)是核仁中含量最丰富的非核糖体磷蛋白家族成员，主要分布在细胞核中，并参与调节多种细胞进程。近年来，多项研究发现NCL的表达和定位可能与肿瘤发生、发展有关[3-7]。一些研究指出，正常组织中NCL蛋白通常主要定位于细胞核，在部分恶性肿瘤中NCL常在肿瘤细胞的细胞质和细胞膜呈现异常高表达，而这种异常表达可能与肿瘤患者预后不良密切相关。
本研究使用生物信息学方法，从mRNA表达水平检测了NCL在EC组织中的表达。并结合肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中临床数据，探讨NCLmRNA表达水平与EC临床病理特征及预后的关系;通过免疫组织化学染色检测Ⅰ型EC组织中NCL蛋白表达，分析NCL蛋白表达水平和分布部位与Ⅰ型EC预后的相关性。
研究目的
1.探究EC组织中NCLmRNA的表达与临床病理特征的相关性，探讨其对患者预后的影响。
2.检测Ⅰ型EC组织中NCL蛋白表达、定位及其与患者预后的关系。
研究方法
1.探究EC组织中NCLmRNA的表达及临床意义:下载TCGA中EC组织及癌旁组织中NCLmRNA数据，分析NCL在EC组织中的表达与患者临床病理特征的相关性，并分析其与预后的关系。
2.检测Ⅰ型EC组织中NCL蛋白的表达、定位及其与预后的关系:利用免疫组织化学染色技术检测82例Ⅰ型EC组织和15例非恶性组织中NCL蛋白的表达和定位，并分析其与患者预后的相关性。
研究结果
1.EC组织中NCLmRNA的表达及意义:本研究从TCGA官方网站下载494例EC患者的RNA测序数据和临床病理资料。利用R软件包“DESeq2”对RNA测序数据进行标准化，整合NCLmRNA数据和临床病理特征及生存数据。根据NCL的mRNA表达量，我们将494例EC患者分为低表达组(n=165)、中表达组(n=165)和高表达组(n=164)。将癌旁组织的RNA表达数据记为癌旁对照组(n=23)。本研究比较了四个组的NCLmRNA表达数据，结果显示癌旁对照组与NCL中表达组无显著差异(P＞0.05);低于NCL高表达组，差异具有统计学意义(P＜0.001);高于NCL低表达组，差异具有统计学意义(P＜0.001)。因此，研究显示NCL高表达组相对于正常组织可能存在NCL表达上调，NCL低表达组相对于正常组织可能存在NCL抑制表达。
2.NCLmRNA在EC组织中的表达水平与临床病理特征的关系
2.1TCGA中患者的临床病理特征:EC患者494例，平均诊断年龄(63.61±11.84)岁。Ⅰ型EC患者377例(76.3％)，Ⅱ型EC患者95例(19.4％)，混合型EC患者24例(4.3％)。组织学分级G3-56.3％(278/494),G2-23.3％(115/494),G1-18.4％(91/494)。FIGOⅠ期62.6％(309/494)，Ⅱ期10.1％(50/494)，Ⅲ期22.5％(111/494)和Ⅳ期4.8％(24/494)。
2.2NCLmRNA表达水平与临床病理特征的关系:NCL在EC组织中的高表达与病理分型(P＜0.001)、FIGO分期(P=0.029)和组织学分级(P＜0.001)显著相关，而与手术方式和年龄无关(P＞0.05)。本研究发现NCL在Ⅱ型EC组织中的表达高于Ⅰ型EC，差异具有显著性(P＜0.001);NCL在Ⅲ+Ⅳ期EC组织中的表达高于Ⅰ+Ⅱ期EC组织，差异有统计学意义(P＜0.01)。NCL在EC组织中的表达量与组织学分级相关，G3级EC组织中NCL表达量高于G1和G2级EC，差异具有显著性(P＜0.001)。以上结果表明NCL表达上调与肿瘤的进展有关。
3.NCLmRNA表达水平与预后之间的关系
3.1NCLmRNA表达水平与EC患者生存时间的关系:本研究通过Kaplan-Meier生存分析绘制NCL高、中、低表达组的总生存曲线和无病生存曲线，并通过Log-rank-Mantel-Cox检验评估NCLmRNA表达水平在EC患者中的预后价值，结果显示NCL高表达组的总生存期(Overall survival，OS)低于中、低表达组，差异有统计学意义(P=0.001)。NCL高表达组的无病生存期(Disease-free survival，DFS)明显低于中、低表达组，差异有统计学意义(P=0.006)。
3.2NCLmRNA表达水平与Ⅰ型EC患者生存时间的关系:本研究通过Kaplan-Meier生存分析绘制NCL高、中、低表达组的总生存曲线和无病生存曲线，并通过Log-rank-Mantel-Cox检验评估NCL在Ⅰ型EC患者中的预后价值，结果显示NCL高表达组的OS低于中、低表达组，差异有统计学意义(P=0.019)。NCL高表达组的DFS明显低于中、低表达组，差异具有统计学意义(P=0.010)。
3.3NCLmRNA表达水平与Ⅱ型EC患者生存时间的关系:本研究通过Kaplan-Meier生存分析绘制Ⅱ型EC患者中NCL高、中、低表达组的总生存曲线和无病生存曲线，并通过Log-rank-Mantel-Cox检验评估NCL在Ⅱ型EC患者中的预后价值。结果显示，三组间的OS和DFS差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.4基于病理分级和FIGO分期的亚组分析结果:本研究通过亚组分析进一步探究NCL在EC组织中的表达及意义。基于病理分级的亚组分析表明，在G1+G2级EC中，NCL高表达组的OS(P=0.037)及DFS(P=0.013)低于中、低表达组，差异具有统计学意义。基于FIGO分期的亚组分析表明，在FIGOⅠ+Ⅱ期肿瘤中，NCL高表达组OS低于中、低表达组，差异有统计学意义(P=0.012)。
3.5NCLmRNA表达水平的预后价值
3.5.1COX比例风险模型分析NCLmRNA表达水平与EC患者预后的关系:单因素分析结果显示，NCL表达量(HR=1.717，95％CI=1.250-2.359，P=0.001)、病理分型(HR=2.215，CI=1.104-4.444，P=0.025)、FIGO分期(HR=4.416，95％CI=2.328-8.377，P＜0.001)和组织学分级(HR=2.839，95％CI=1.293-6.234，P=0.009)与EC患者的OS显著相关。NCL表达量(HR=1.404,95％CI=1.134-1.739,P=0.002)、FIGO分期(HR=3.090,95％CI=2.021-4.723，P＜0.001)与EC患者的DFS显著相关。多因素分析结果显示，NCL表达量是影响DFS的独立预后标志物(HR=1.282，CI=1.027-1.601,P=0.028)。
3.5.2COX比例风险模型分析NCLmRNA表达水平与Ⅰ型EC患者预后的关系:单因素分析结果显示，NCL表达量(HR=1.490，CI=1.145-1.938，P=0.003)和FIGO分期(HR=2.736，CI=1.619-4.623，P＜0.001)是影响Ⅰ型EC患者DFS的因素。多因素分析结果显示，NCL表达量(HR=1.411，CI=1.083-1.840,P=0.011)和FIGO分期(HR=2.516,CI=1.483-4.270,P=0.001)是影响DFS的独立预后因素。
4.Ⅰ型EC患者的临床病理特征及NCL蛋白在EC组织中的表达
4.1患者的临床病理特征:本研究纳入82例Ⅰ型EC患者，平均诊断年龄(55.16+9.73)岁。组织学分级G3-15.9％(13/82)，G2-34.1％(28/82)，G1-50％(41/82)。FIGOⅠ+Ⅱ期86.6％(71/82),Ⅲ+Ⅳ期13.4％(11/82)。28％(23/82)有深肌层浸润，9.8％(8/82)有宫颈侵犯。8.5％(7/82)有盆腔淋巴结和(或)腹主动脉旁淋巴结转移。89.0％(71/82)的患者接受了开腹手术，11％(9/82)接受了腹腔镜手术。
非恶性疾病患者15例，平均诊断年龄(59.22±10.62)岁。子宫肌瘤46.7％(7/15)，子宫腺肌病33.3％(5/15)，异常子宫出血20％(3/15)例。86.7％(13/15)的患者接受了开腹手术86.7％(13/15)。
4.2NCL蛋白在Ⅰ型EC组织中的表达水平及部位:免疫组化结果显示，在正常子宫内膜组织中，NCL蛋白主要在细胞核中表达，未见明显核外表达。仅在部分Ⅰ型EC组织中，NCL蛋白可在细胞核外表达。NCL在正常组织和EC组织的细胞核内中均有染色，只有在34例(41.5％)Ⅰ型EC中存在细胞核外NCL表达。结果表明在部分肿瘤细胞中，NCL可能迁移到细胞核外表达。
5.NCL蛋白表达水平和分布部位与Ⅰ型EC患者预后的关系
5.1NCL蛋白表达水平和分布部位与Ⅰ型EC患者生存时间的关系:通过Kaplan-Meier生存分析绘制生存曲线，并通过Log-rank-Mantel-Cox检验评估NCL蛋白在细胞核内、外表达水平的预后价值。核内NCL低表达组患者的DFS明显低于核内NCL高表达组患者，差异有统计学意义(P=0.001)。核外NCL阳性表达组的DFS低于阴性表达组，差异有统计学意义(P=0.031)。
5.2COX比例风险模型分析Ⅰ型EC患者中NCL蛋白表达与预后的关系:单因素分析结果显示，核外NCL阳性表达(HR=3.398，95％CI=1.046-11.038，P=0.042)、核内NCL表达(HR=0.178，95％CI=0.055-0.580，P=0.004)和FIGO分期(HR=3.647，95％CI=1.121-11.864，P=0.032)与Ⅰ型EC患者的DFS显著相关(表7)。核外NCL阳性表达及核内NCL低表达的EC患者出现不良结局的风险较高。多因素分析的结果显示，核外NCL阳性表达(HR=3.377，95％CI=1.029-11.186，P=0.046)和核内NCL低表达(HR=0.233，95％CI=0.068-0.796，P=0.020)以及FIGO分期(HR=3.435，95％CI=1.009-11.690，P=0.048)是影响Ⅰ型EC患者DFS的独立预后因素。
研究结论
1.NCLmRNA在EC组织中的表达与FIGO分期和组织学分级显著相关，NCLmRNA过表达可能与EC的进展相关。
2.NCLmRNA高表达与EC患者临床预后不良相关。
3.在正常子宫内膜组织中，NCL蛋白主要在细胞核中表达，未见明显核外表达。仅在部分Ⅰ型EC患者肿瘤细胞中，NCL蛋白可在细胞核内和细胞核外表达。
4.在Ⅰ型EC组织中，核外NCL阳性表达和核内NCL低表达与患者临床预后不良相关。
子宫内膜癌(Endometrial Cancer，EC)是全球最常见的妇科恶性肿瘤之一，占女性恶性肿瘤总数的7％，约占女性生殖系统恶性肿瘤的20％-30％。据估计，2021年美国新发子宫体肿瘤病例数为66570例，预计死亡人数12940例[1]。此外，EC的发病率和死亡率在过去十年中稳步上升。目前，EC在临床上主要是根据国际妇产科联合会(Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期、肿瘤组织学分级和组织学类型进行风险分层。需要注意的是，具有相似临床病理特征的EC患者常出现不同的疾病结局，影响肿瘤侵袭和转移的分子表型的差异可能是导致这一现象的重要原因之一[2]。
核仁蛋白(Nucleolin，NCL)是核仁中含量最丰富的非核糖体磷蛋白家族成员，主要分布在细胞核中，并参与调节多种细胞进程。近年来，多项研究发现NCL的表达和定位可能与肿瘤发生、发展有关[3-7]。一些研究指出，正常组织中NCL蛋白通常主要定位于细胞核，在部分恶性肿瘤中NCL常在肿瘤细胞的细胞质和细胞膜呈现异常高表达，而这种异常表达可能与肿瘤患者预后不良密切相关。
本研究使用生物信息学方法，从mRNA表达水平检测了NCL在EC组织中的表达。并结合肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中临床数据，探讨NCLmRNA表达水平与EC临床病理特征及预后的关系;通过免疫组织化学染色检测Ⅰ型EC组织中NCL蛋白表达，分析NCL蛋白表达水平和分布部位与Ⅰ型EC预后的相关性。
研究目的
1.探究EC组织中NCLmRNA的表达与临床病理特征的相关性，探讨其对患者预后的影响。
2.检测Ⅰ型EC组织中NCL蛋白表达、定位及其与患者预后的关系。
研究方法
1.探究EC组织中NCLmRNA的表达及临床意义:下载TCGA中EC组织及癌旁组织中NCLmRNA数据，分析NCL在EC组织中的表达与患者临床病理特征的相关性，并分析其与预后的关系。
2.检测Ⅰ型EC组织中NCL蛋白的表达、定位及其与预后的关系:利用免疫组织化学染色技术检测82例Ⅰ型EC组织和15例非恶性组织中NCL蛋白的表达和定位，并分析其与患者预后的相关性。
研究结果
1.EC组织中NCLmRNA的表达及意义:本研究从TCGA官方网站下载494例EC患者的RNA测序数据和临床病理资料。利用R软件包“DESeq2”对RNA测序数据进行标准化，整合NCLmRNA数据和临床病理特征及生存数据。根据NCL的mRNA表达量，我们将494例EC患者分为低表达组(n=165)、中表达组(n=165)和高表达组(n=164)。将癌旁组织的RNA表达数据记为癌旁对照组(n=23)。本研究比较了四个组的NCLmRNA表达数据，结果显示癌旁对照组与NCL中表达组无显著差异(P＞0.05);低于NCL高表达组，差异具有统计学意义(P＜0.001);高于NCL低表达组，差异具有统计学意义(P＜0.001)。因此，研究显示NCL高表达组相对于正常组织可能存在NCL表达上调，NCL低表达组相对于正常组织可能存在NCL抑制表达。
2.NCLmRNA在EC组织中的表达水平与临床病理特征的关系
2.1TCGA中患者的临床病理特征:EC患者494例，平均诊断年龄(63.61±11.84)岁。Ⅰ型EC患者377例(76.3％)，Ⅱ型EC患者95例(19.4％)，混合型EC患者24例(4.3％)。组织学分级G3-56.3％(278/494),G2-23.3％(115/494),G1-18.4％(91/494)。FIGOⅠ期62.6％(309/494)，Ⅱ期10.1％(50/494)，Ⅲ期22.5％(111/494)和Ⅳ期4.8％(24/494)。
2.2NCLmRNA表达水平与临床病理特征的关系:NCL在EC组织中的高表达与病理分型(P＜0.001)、FIGO分期(P=0.029)和组织学分级(P＜0.001)显著相关，而与手术方式和年龄无关(P＞0.05)。本研究发现NCL在Ⅱ型EC组织中的表达高于Ⅰ型EC，差异具有显著性(P＜0.001);NCL在Ⅲ+Ⅳ期EC组织中的表达高于Ⅰ+Ⅱ期EC组织，差异有统计学意义(P＜0.01)。NCL在EC组织中的表达量与组织学分级相关，G3级EC组织中NCL表达量高于G1和G2级EC，差异具有显著性(P＜0.001)。以上结果表明NCL表达上调与肿瘤的进展有关。
3.NCLmRNA表达水平与预后之间的关系
3.1NCLmRNA表达水平与EC患者生存时间的关系:本研究通过Kaplan-Meier生存分析绘制NCL高、中、低表达组的总生存曲线和无病生存曲线，并通过Log-rank-Mantel-Cox检验评估NCLmRNA表达水平在EC患者中的预后价值，结果显示NCL高表达组的总生存期(Overall survival，OS)低于中、低表达组，差异有统计学意义(P=0.001)。NCL高表达组的无病生存期(Disease-free survival，DFS)明显低于中、低表达组，差异有统计学意义(P=0.006)。
3.2NCLmRNA表达水平与Ⅰ型EC患者生存时间的关系:本研究通过Kaplan-Meier生存分析绘制NCL高、中、低表达组的总生存曲线和无病生存曲线，并通过Log-rank-Mantel-Cox检验评估NCL在Ⅰ型EC患者中的预后价值，结果显示NCL高表达组的OS低于中、低表达组，差异有统计学意义(P=0.019)。NCL高表达组的DFS明显低于中、低表达组，差异具有统计学意义(P=0.010)。
3.3NCLmRNA表达水平与Ⅱ型EC患者生存时间的关系:本研究通过Kaplan-Meier生存分析绘制Ⅱ型EC患者中NCL高、中、低表达组的总生存曲线和无病生存曲线，并通过Log-rank-Mantel-Cox检验评估NCL在Ⅱ型EC患者中的预后价值。结果显示，三组间的OS和DFS差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.4基于病理分级和FIGO分期的亚组分析结果:本研究通过亚组分析进一步探究NCL在EC组织中的表达及意义。基于病理分级的亚组分析表明，在G1+G2级EC中，NCL高表达组的OS(P=0.037)及DFS(P=0.013)低于中、低表达组，差异具有统计学意义。基于FIGO分期的亚组分析表明，在FIGOⅠ+Ⅱ期肿瘤中，NCL高表达组OS低于中、低表达组，差异有统计学意义(P=0.012)。
3.5NCLmRNA表达水平的预后价值
3.5.1COX比例风险模型分析NCLmRNA表达水平与EC患者预后的关系:单因素分析结果显示，NCL表达量(HR=1.717，95％CI=1.250-2.359，P=0.001)、病理分型(HR=2.215，CI=1.104-4.444，P=0.025)、FIGO分期(HR=4.416，95％CI=2.328-8.377，P＜0.001)和组织学分级(HR=2.839，95％CI=1.293-6.234，P=0.009)与EC患者的OS显著相关。NCL表达量(HR=1.404,95％CI=1.134-1.739,P=0.002)、FIGO分期(HR=3.090,95％CI=2.021-4.723，P＜0.001)与EC患者的DFS显著相关。多因素分析结果显示，NCL表达量是影响DFS的独立预后标志物(HR=1.282，CI=1.027-1.601,P=0.028)。
3.5.2COX比例风险模型分析NCLmRNA表达水平与Ⅰ型EC患者预后的关系:单因素分析结果显示，NCL表达量(HR=1.490，CI=1.145-1.938，P=0.003)和FIGO分期(HR=2.736，CI=1.619-4.623，P＜0.001)是影响Ⅰ型EC患者DFS的因素。多因素分析结果显示，NCL表达量(HR=1.411，CI=1.083-1.840,P=0.011)和FIGO分期(HR=2.516,CI=1.483-4.270,P=0.001)是影响DFS的独立预后因素。
4.Ⅰ型EC患者的临床病理特征及NCL蛋白在EC组织中的表达
4.1患者的临床病理特征:本研究纳入82例Ⅰ型EC患者，平均诊断年龄(55.16+9.73)岁。组织学分级G3-15.9％(13/82)，G2-34.1％(28/82)，G1-50％(41/82)。FIGOⅠ+Ⅱ期86.6％(71/82),Ⅲ+Ⅳ期13.4％(11/82)。28％(23/82)有深肌层浸润，9.8％(8/82)有宫颈侵犯。8.5％(7/82)有盆腔淋巴结和(或)腹主动脉旁淋巴结转移。89.0％(71/82)的患者接受了开腹手术，11％(9/82)接受了腹腔镜手术。
非恶性疾病患者15例，平均诊断年龄(59.22±10.62)岁。子宫肌瘤46.7％(7/15)，子宫腺肌病33.3％(5/15)，异常子宫出血20％(3/15)例。86.7％(13/15)的患者接受了开腹手术86.7％(13/15)。
4.2NCL蛋白在Ⅰ型EC组织中的表达水平及部位:免疫组化结果显示，在正常子宫内膜组织中，NCL蛋白主要在细胞核中表达，未见明显核外表达。仅在部分Ⅰ型EC组织中，NCL蛋白可在细胞核外表达。NCL在正常组织和EC组织的细胞核内中均有染色，只有在34例(41.5％)Ⅰ型EC中存在细胞核外NCL表达。结果表明在部分肿瘤细胞中，NCL可能迁移到细胞核外表达。
5.NCL蛋白表达水平和分布部位与Ⅰ型EC患者预后的关系
5.1NCL蛋白表达水平和分布部位与Ⅰ型EC患者生存时间的关系:通过Kaplan-Meier生存分析绘制生存曲线，并通过Log-rank-Mantel-Cox检验评估NCL蛋白在细胞核内、外表达水平的预后价值。核内NCL低表达组患者的DFS明显低于核内NCL高表达组患者，差异有统计学意义(P=0.001)。核外NCL阳性表达组的DFS低于阴性表达组，差异有统计学意义(P=0.031)。
5.2COX比例风险模型分析Ⅰ型EC患者中NCL蛋白表达与预后的关系:单因素分析结果显示，核外NCL阳性表达(HR=3.398，95％CI=1.046-11.038，P=0.042)、核内NCL表达(HR=0.178，95％CI=0.055-0.580，P=0.004)和FIGO分期(HR=3.647，95％CI=1.121-11.864，P=0.032)与Ⅰ型EC患者的DFS显著相关(表7)。核外NCL阳性表达及核内NCL低表达的EC患者出现不良结局的风险较高。多因素分析的结果显示，核外NCL阳性表达(HR=3.377，95％CI=1.029-11.186，P=0.046)和核内NCL低表达(HR=0.233，95％CI=0.068-0.796，P=0.020)以及FIGO分期(HR=3.435，95％CI=1.009-11.690，P=0.048)是影响Ⅰ型EC患者DFS的独立预后因素。
研究结论
1.NCLmRNA在EC组织中的表达与FIGO分期和组织学分级显著相关，NCLmRNA过表达可能与EC的进展相关。
2.NCLmRNA高表达与EC患者临床预后不良相关。
3.在正常子宫内膜组织中，NCL蛋白主要在细胞核中表达，未见明显核外表达。仅在部分Ⅰ型EC患者肿瘤细胞中，NCL蛋白可在细胞核内和细胞核外表达。
4.在Ⅰ型EC组织中，核外NCL阳性表达和核内NCL低表达与患者临床预后不良相关。