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研究背景与目的目前急性脑卒中已成为中国人致死性疾病的首位原因,及时恢复半暗带脑血流是最直接有效的治疗方式。但早期脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)后容易诱导产生大量氧自由基、瀑布式炎症反应、坏死和凋亡等级联反应,多种因素间互相作用,造成二次脑损伤。因此,成功发展作用于脑卒中多种分子机制的治疗方式是迫切需要的。1997年美国食品和药品监督局(Food and Drug Administration,FDA)推荐VNS (vagus nerve stimulation, VNS)应用于部分发作性难治性癫痫患者,随后多个国家相继批准。近年来,国外研究发现VNS对急性脑缺血再灌注大鼠具有神经保护作用,但其机制不明确。本研究拟通过VNS对急性脑缺血再灌注后氧化应激、凋亡、炎症反应的影响及可能分子机制进行深入探讨,为其临床应用提供一定理论依据。研究方法第一部分：采用颅内注射antagmiR210抑制内源性miR210表达,线栓法制备右侧大脑中动脉栓塞／再灌注(Middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)模型,梗塞30min后给予VNS干预。MCAO手术及电刺激过程监测心率、尾动脉血压、血气以及右侧大脑中动脉供血区脑血流变化。再灌注24h时,荧光定量PCR检测各组miR210表达。采用Bederson 5分制评估再灌注24h时神经体征损伤、测定脑梗死体积；(Tdt-mediated dutp nick end labeling, TUNEL)原位凋亡检测技术检测缺血侧皮层神经元凋亡数量；ELISA检测缺血侧脑组织氧化应激反应水平(Superoxide Dismutase, SOD)、(Maleic Dialdehyde assay, MDA)、(Glutathione, GSH)。Western blot技术检测各组缺血侧皮层p-Akt和caspase-3活性蛋白表达情况,免疫荧光染色测各组缺血皮层caspase-3阳性细胞表达。第二部分：采用颅内注射PPARyRNAi技术抑制PPARy (Peroxisome proliferator -activated receptor y, PPARy)表达,构建右侧大脑中动脉栓塞/再灌注模型,梗塞30min后VNS干预,荧光定量PCR和Western blot技术检测各组缺血侧皮层PPARy基因和蛋白表达；采用Ludmila Belayev 12分制评估神经功能缺失和脑梗死体积;HE染色显示各组缺血侧脑组织的病理变化；免疫荧光双标检测缺血侧皮层小胶质细胞和星形胶质细胞表面a7乙酰胆碱能受体(a7nicotinic acetylcholine receptor, a7nAchR)表达；ELISA检测缺血侧脑组织肿瘤坏死因子a(Tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素-1β(Interleukin 1β, IL-1β)含量水平。研究结果第一部分：(1)实验过程中,VNS对大鼠心率(Heart rate, HR)、血压(Blood pressure, BP)、血气及右侧大脑中动脉供血区脑血流无明显影响(p>0.05)；(2)与缺血组(I/R)相比,VNS进一步增加缺血诱导的miR210表达(p<0.05),改善脑缺血再灌注急性期神经功能症状缺失和减少脑梗死体积,减少缺血侧皮层神经元凋亡数量(p<0.05),沉默miR210后,进一步加重缺血导致的脑组织损伤同时也减少VNS神经保护作用(p<0.05),提示miR210参与VNS的神经保护效应。(3)与假手术组(sham I/R)相比,缺血后导致大鼠缺血侧皮层SOD活性下降、GSH含量减少和MAD含量增加；与缺血组(I/R)相比,VNS明显抑制缺血侧脑组织氧化应激水平(p<0.05)；沉默miR210后,进一步加重再灌注诱导的氧化应激反应(p<0.05),同时削弱VNS抗氧化应激效应(p<0.05)。(4)与假手术组(sham I/R)相比,缺血再灌注后缺血侧脑组织p-Akt含量减少(p<0.05),VNS干预后逆转缺血抑制p-Akt表达的效应(p<0.05),并且p-Akt蛋白变化与antagomiR210干扰无明显关联性(p>0.05)。(5)与假手术组(sham I/R)相比,缺血组(I/R)缺血侧皮层caspase 3活性蛋白表达明显增加(p<0.05)；沉默miR210后,进一步增加缺血侧脑组织caspase3活性(p<0.05),而VNS后可抑制缺血侧皮层caspase 3活性蛋白表达(p<0.05)；沉默miR210后,明显减弱VNS抑制凋亡反应效应(p<0.05),各组免疫荧光caspase 3活性细胞变化趋势同蛋白表达基本一致,提示miR210参与VNS对氧化应激和凋亡的调控过程。第二部分：(1)荧光定量PCR和Western blot法检测颅内注射PPARyRNAi干预后各组PPARy表达示：与缺血+阴性病毒对照组(I/R+ LV-control)相比,缺血+电刺激+阴性病毒对照组(I/R+VNS+LV-control)中PPARγ基因和蛋白表达明显上调(p<0.05)；PPARyRNAi干扰后,缺血+干扰组(I/R+LV-shPPARr)和缺血+电刺激+干扰组(I/R+VNS+LV-shPPARr)两组基因蛋白表达明显下降(p<0.05)。(2)再灌注24h时,VNS改善神经功能症状缺失,减少脑梗死体积,减轻脑组织病理损伤,抑制缺血侧皮层炎症因子(TNF-α、IL-1β)水平(p<0.05)；PPARyRNAi干扰后,VNS保护效应明显下降,炎症因子水平增加(p<0.05),提示PPAR γ参与VNS对炎症反应的抑制过程。(3)免疫荧光显示VNS同时可以激活缺血侧皮层小胶质细胞和星形胶质细胞表面a7nAchR,调控神经免疫细胞形态和功能,发挥抗炎作用。结论(1)VNS改善急性脑缺血再灌注大鼠神经功能症状缺失和减少脑梗死体积。(2)VNS减少急性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带神经元凋亡数量。(3)VNS减少急性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带氧化应激和凋亡反应。(4)电刺激迷走神经减少急性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带炎症反应。(5)miR210表达活动影响氧化应激和凋亡反应,参与了电刺激迷走神经对急性脑缺血再灌注大鼠脑保护作用。PPARy表达活动调节脑缺血再灌注后炎症反应参与了电刺激迷走神经对急性脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用。