应用酵母双杂交系统筛选与NPR-A相互作用的蛋白

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传统上认为家族性房颤是离子通道基因突变导致的离子通道病。2008年,非离子通道基因NPPA、NUP155突变导致家族性房颤的发现,拓宽了人们对房颤机制的认识。继发现首个致病突变后,我们中心通过候选基因测序发现了多个NPPA基因新的序列改变。NPPA在心房细胞内经过一系列加工生成心房利钠肽(atrial natriureticpeptide,ANP)。在其受体中,利钠肽受体-A(NPR-A)与ANP亲合力最高,NPR-A存在于心脏、血管等多种组织中,结合ANP后通过第二信使环鸟苷酸(cGMP)等多种途径发挥血压调节、利钠利尿及心血管稳态等生物学效应。但是其各组织内的活性调控机制尚不清楚。本研究通过酵母双杂交系统筛选与NPR-A相互作用的蛋白,以期完善ANP与NPR-A的信号转导通路,进一步了解房颤的发生机制。实验选用Clontech MatchmakerTMGAL4Two-Hybrid System3,以NPR-A胞内段(NPR-A-ICD)为诱饵蛋白,对人心脏cDNA文库进行筛选。首先,构建了诱饵质粒pGBKT7-NPR-A-ICD,转化AH109酵母细胞,经检测诱饵蛋白未发现自激活和毒性作用并且融合蛋白大小表达正确;然后,将诱饵质粒转化Y187酵母细胞,与保存在AH109酵母细胞的人心脏cDNA文库进行Yeast Mating,通过四缺营养培养基初步筛选到13个酵母阳性克隆;再次将阳性克隆划线到四缺平板和β-半乳糖苷酶滤纸显色反应筛选后得到1个阳性克隆,提取文库质粒测序。通过Blast比对,发现文库质粒插入的cDNA序列与ⅡA分泌型磷脂酶A2(Human PLA2G2A)具有99℅的同源性,PLA2G2A与NPR-A可能存在相互作用。下一步拟通过回归验证、Co-IP、GSTPull down以及细胞共定位进行确认。
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