论文部分内容阅读
植物的木质纤维素是世界上分布最广的可再生资源,目前对于利用降解木质纤维素得到的产物生产生物燃料成为研究的热点。但是由于新兴生物燃料的高成本,使得其与传统石化燃料在应用推广上相比不具有竞争力。在生产生物燃料的过程中,降解木质纤维素所需的纤维素酶的费用在生产成本中所占比重很大。提高纤维素酶产量,构建纤维素酶高产菌株是解决这一问题的主要技术手段。目前工业生产上已经成功构建许多的高产纤维素酶生产菌株,如纤维素酶生产的明星菌株Trichoderma reesei RUT-C30。通过比较基因组学研究发现与出发菌株T.reesei strain QM6a相比RUT-C30菌株中多处发生突变,但是该菌株在遗传操作方面存在一定的困难,所以目前对其高产机制尚不明确。而Neurospora crassa有着与T.reesei有着非常近的亲缘关系,还具有非常简便的遗传操作手段,近年来已逐渐成为研究产酶机理的理想菌株。所以,为研究RUT-C30菌株的高产机制,以N.crassa为研究对象,针对RUT-C30菌株中突变基因,筛选粗糙脉孢菌中的单基因敲除突变体,挖掘这些基因的功能,为改造高产菌株、研究产酶机理提供新的研究方向。木质纤维素的水解需要三种酶的协同作用来完成,而高效的内切纤维素酶与β-葡萄糖苷酶可促使纤维素水解效率得到显著的提高,降低降解木质纤维素的费用,进而促进生物燃料的推广应用。因此在本研究中,分别克隆表达了一个内切纤维素酶AgCel5A和一个β-葡萄糖苷酶NcBGL2,并对其性质进行了分析。以期获得高效的纤维素酶,用来提高纤维素的水解效率,进而达到降低成纤维素酶成本的目的。传统的纤维素酶是由内切纤维素酶、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶三种组份组成的。但是有没有存在另一种组份,可以使现有的传统纤维素酶系的水解活性得到进一步的提升呢?AA9家族的溶解性多糖单加氧酶就具有这种功能。溶解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenases)简称LPMOs,即原来的GH61蛋白,可以通过与CDH(Cellobiose dehydrogenases)或者一些低分子量的还原剂(如抗坏血酸)发生氧化还原反应,裂解纤维素链上的糖苷键,破坏其结构,从ii而使纤维素更容易被纤维素酶降解,提高传统纤维素酶的水解效率。嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)是一株嗜热真菌,具有很强的纤维素降解能力,目前已经从该菌株中克隆得到了许多的纤维素酶基因。在本研究中,克隆了两个在m.thermophila表达量最高的lpmo基因,并对其性质进行了分析,以期达到提高原有纤维素酶系水解活性,促进纤维素水解,降低纤维素酶成本,从而促进生物燃料的可持续发展的目的。本研究的主要研究结果如下:(1)利用n.crassa基因敲除突变体库对t.reeseirut-c30中的突变基因进行表型验证,成功筛选得到12株胞外蛋白分泌升高25%以上的突变菌株,4株分泌下降25%以上的菌株;明确编码ap-3复合体μ亚基的ncap3m(ncu03998)和编码β亚基的ncap3b(ncu06569)的缺失可显著提高胞外蛋白的分泌;ncap3m和ncap3b的缺失还会导致n.crassa菌株的分泌应激引起的转录抑制(repressedexpressionofsecretedsequences,ress)现象减弱;最后证明ap-3复合体与纤维素酶分泌途径相关,ap-3复合体功能缺失后会导致纤维素酶的分泌提高。(2)成功克隆得到了一个高效的内切纤维素酶agcel5a和一个β-葡萄糖苷酶ncbgl2,二者在pichapastori中异源表达后,发酵液中均为单一条带;agcel5a最适反应条件为ph5.0,55°c,具有良好的热稳定性和ph稳定性,同时还具有极强的耐盐性,而且co2+可有效促进酶活提高;ncbgl2的最适反应条件为ph5.6,60°c,10%的乙醇可提高80%酶活,还具有非常强的水解大豆异黄酮糖苷活性。(3)水解纤维素的过程中,将mtlpmo9a与mtlpmo9b添加到原有纤维素酶系中时,均可以使最终酶用量减少40%;在n.crassa菌株中表达这两个lpmo蛋白可直接实现纤维素酶系优化,但需保证lpmo蛋白的分泌量。综上所述,通过本文的研究,获得了一个高效的内切纤维素酶agcel5a和一个β-葡萄糖苷酶ncbgl2,而性质优良的内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶在生物炼制特别是生物燃料的可持续发展上具有重要意义;还获得了两个可以有效的提高传统纤维素酶的水解活性lpmo蛋白,降低纤维素酶的用量,节约纤维素酶成本,同样在促进生物燃料的推广应用上具有着重大意义;最后证明了可以利用模式真菌n.crassa,开展对t.reeseirut-c30的突变基因进行功能研究,以明确t.reeseirut-c30高产机理。并确定ap-3复合体与纤维素酶分泌途径相关。该研究结果为纤维素酶分泌方面的研究提供一个新的方向,也为今后高分泌菌株改良提出一个新策略。