【摘 要】
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PCV2可在淋巴系统内增殖引起机体免疫抑制,诱发其他病原的继发感染和混合感染,如猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪链球菌等。自20世纪90年代末以来,PCV2已成为全球猪的主要病原体,PCV2主要感染4-16周龄的猪,表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、生殖障碍和呼吸系统疾病,给全球养猪业造成巨大的危害。研究发现PCV2全基因组的11个ORF(开放阅读框)中ORF2基
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PCV2可在淋巴系统内增殖引起机体免疫抑制,诱发其他病原的继发感染和混合感染,如猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪链球菌等。自20世纪90年代末以来,PCV2已成为全球猪的主要病原体,PCV2主要感染4-16周龄的猪,表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、生殖障碍和呼吸系统疾病,给全球养猪业造成巨大的危害。研究发现PCV2全基因组的11个ORF(开放阅读框)中ORF2基因是主要编码与病毒结构相关的Cap蛋白(核衣壳蛋白)的基因,Cap蛋白是病毒重要的免疫原性蛋白,可诱导机体产生抗PCV2的中和抗体。国际上根据ORF2中不同核苷酸位点比例将PCV2分为5种基因型:PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e。多项研究表明,PCV2b具有高致病性,为我国前期流行的主要基因亚型,相继研究表明PCV2基因型在全球发生了从PCV2b到PCV2d的基因型动态转移。猪群防控圆环病最经济有效的方式是免疫接种特异性强的疫苗。目前市场上的疫苗基本上是基于PCV2a和PCV2b进行的研发,对PCV2d的保护不足。PCV2基因型间可能存在重组。因此对PCV2分子流行病学研究至关重要。为探明2019-2020年我国中南地区猪场中PCV2的流行情况,评估基于杆状病毒的PCV2b CaP蛋白和PCV2d CaP蛋白对PCV2b和PCV2d感染的交叉保护能力,为中国PCVAD的防控和PCV2疫苗的开发提供参考。选择2019年到2020年从该地区414个规模化猪场收集的1707份疑似PCV2感染样本,通过荧光定量PCR方法进行PCV2的检测。随机选取我国中南7个省份的50份PCV2阳性样品ORF2基因进行PCR扩增,胶回收后送测序,利用Meg Align软件进行了同源性分析,利用MEGA6进行分子遗传进化分析。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen,美国),按照制造商的说明构建PCV2b和PCV2d Cap蛋白的重组杆状病毒,采用免疫荧光法计算重组杆状病毒的滴度。用rBac-2b Cap和rBac-2d Cap感染Sf9细胞,收集并纯化表达的重组Cap蛋白,组装成病毒样颗粒(VLPs)。开展动物免疫安全试验及攻毒试验,对以杆状病毒为基础的PCV2b Cap和PCV2d Cap蛋白对PCV2b和PCV2d感染的同源和异源保护能力进行了评估。结果显示1707份样本中PCV2检出率为36.08%(616/1707),414个猪场PCV2检出率为49.03%(203/414),不同样品中肺脏检出为41.31%、胎儿检出率为34.51%、血样检出率为31.97%、精液检出率为4.12%。50株PCV2之间的ORF2核酸序列同源性为84.1%~100%,与18个参考序列的核苷酸序列同源性为75.6%~99.8%。遗传进化分析显示PCV2d占80%(40/50),PCV2a占4%(2/50),PCV2b占16%(8/50),未检测到PCV2c和PCV2e,其中PCV2d为河南、湖北、湖南、四川、山东、云南、广东等省份的主要基因型。研究发现基于杆状病毒的PCV2b Cap蛋白和PCV2d Cap蛋白可以产生特异性抗PCV2b IgG和PCV2d IgG抗体,同时,它们可以减少PCV2感染引起的病毒血症,刺激TH1细胞分泌小鼠伽马干扰素(IFN-γ)细胞因子。杆状病毒系统表达的PCV2b Cap和PCV2d Cap蛋白均能刺激小鼠的体液免疫水平和细胞免疫应答水平。这两种蛋白对PCV2b和PCV2d毒株具有一定的同源性和异源性免疫应答,PCV2d Cap蛋白对机体的保护率优于PCV2b Cap蛋白,而PCV2b Cap蛋白在减少病毒血症方面的效果优于PCV2d Cap蛋白。综上所述2019-2020年我国中南地区PCV2的主要流行基因型是PCV2d,其次为PCV2a和PCV2b。PCV2b Cap和PCV2d Cap蛋白对PCV2b和PCV2d毒株具有一定的交叉保护作用。本研究对后续的PCV2的同源和异源免疫应答防治及合适疫苗的制备具有重要意义。
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