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目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是目前最常见的神经退行性疾病之一,由异常过度磷酸化的tau蛋白聚集而形成的神经纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFTs）是AD重要的病理标志。Tau蛋白是在中枢神经系统系统表达的主要微管相关蛋白,正常人脑表达六种异构体。外显子10编码第二个微管结合序列（the second microtubule binding repeat,R2）,它的表达与否将tau异构体分成3R-tau和4R-tau。AD患者脑中的NFTs具有6种tau的亚型,而有些tau蛋白病是由不同的tau亚型组合而成。在AD患者脑中tau病理沿着有神经解剖联系的脑区扩散,和AD的临床进程密切相关。最近的研究表明,病理性聚集的tau具有朊样活性。N-端和C-端的截断使得tau更容易被AD O-tau（oligomeric tau derived from AD brain）猎获并诱导聚集,截断可能触发tau的聚集和朊样激活。病理性tau在有轴突联系的脑区间的传播需要其在轴突中传输。然而,病理性tau在大脑以轴突为主要成分的白质中的特性及朊样活性未见报道,对3R-tau和4R-tau在朊样聚集中的特性也缺乏深入了解。本课题的主要目的是探讨AD患者大脑灰质和白质中tau特性和朊样活性,研究外显子10编码产物R2在截断触发tau的聚集和朊样激活中的作用。第一部分:AD患者大脑灰质和白质中tau的朊样活性方法:1.AD患者大脑额叶灰质和白质匀浆,在10,000×g离心10 min,获得灰质和白质粗提物。2.采用Immuno-dot-blots分析AD患者大脑灰质和白质粗提物中tau的含量。3.用位点特异性、磷酸化依赖性tau抗体进行Western blots,分析AD患者大脑灰质和白质中及培养的细胞中tau的磷酸化水平。4.用含等量tau的大脑灰质和白质的粗提物处理过表达HA-Tau151-391的HEK-293FT细胞,RIPA buffer裂解细胞,超速离心获得RIPA可溶性/不溶性（soluble/insoluble）组分,通过Western blots分析RIPA可溶性和不溶性tau的水平,不溶性tau的水平反应朊样活性的高低。结果:1.正常对照人脑灰质和白质tau的水平相当,AD患者大脑灰质tau的水平高于对应的白质,也高于对照人脑灰质。2.AD大脑灰质和白质中tau的磷酸化水平明显增加,并呈现十二烷基硫酸钠-（Sodium dodecyl sulfate,SDS）和β-巯基乙醇-（β-Mercaptoethanol,β-ME）抵抗高分子量tau（High molecular weight tau,HMW-tau）,灰质比白质有更高的tau磷酸化水平。3.AD大脑灰质和白质中的tau具有朊样活性,在培养的细胞中能诱导tau的聚集,但灰质中的tau比白质的tau表现出更强的朊样活性。4.人脑中tau的朊样活性与tau的磷酸化水平和磷酸化HMW-tau水平呈正相关。5.AD大脑中粗提物处理细胞获得的RIPA不溶性tau在多个位点呈现异常过度磷酸化,但RIPA可溶性tau的磷酸化水平相似,对细胞总tau的磷酸化影响也不大。结论:正常人脑灰质和白质含有相当水平的tau,但在AD大脑灰质中有明显的过度磷酸化的tau的累积。AD大脑灰质和白质均含有朊样活性的病理性tau,可诱导过度磷酸化tau的聚集,但AD灰质中病理性tau的朊样活性明显高于白质。第二部分:外显子10编码产物R2在截断触发tau聚集和朊样激活中的作用方法:1.用AD O-tau处理过表达HA-4R-tau151-391（4R）的HEK-293FT细胞,RIPA buffer裂解细胞,超速离心获得含RIPA不溶性聚集的tau,被定义为第一代seeds（I-seeds）,用I-seeds处理HEK-293FT/tau151-391细胞,获得RIPA不溶性的II-seeds。用含等量tau水平的tau seeds处理HEK-293FT/tau151-391细胞,Western blots分析RIPA可溶性和不溶性tau的水平。2.以同样反复冻融的AD O-tau作为对照,用反复冻融1-3次的II-seeds处理HEK-293/HA-tau151-391,用Western blots分析RIPA可溶性和不溶性tau、磷酸化tau（pT217-tau）的水平。3.在HEK-293FT细胞中过表达HA-3R-tau151-391(3R-tauTr)和4R-tau151-391(4R-tauTr),用Western blots分析其位点特异性磷酸化。4.在HEK-293FT细胞中过表达3R-tauTr和4R-tauTr,超声裂解细胞,离心获得含3R-tauTr、4R-tauTr的抽提液,用Overlay assay分析AD O-tau对他们的猎获。5.在HEK-293FT细胞中过表达3R-tauTr和4R-tauTr,RIPA不溶性的tau被定义为第一代seeds（I-seeds）。用对应的I-seeds分别处理HEK-293FT/3R-tauTr或HEK-293FT/4R-tauTr细胞,获得RIPA不溶性的II-seeds;重复实验步骤,获得III-seeds和IV-seeds。然后用Immuno-dot-blots分析四代细胞中RIPA可溶性tau和不溶性tau的水平,获得RIPA不溶性tau的相对比例。6.用含有等量tau的三代3R-tauTr和4R-tauTr seeds分别处理HEK-293FT/3R-tauTr或HEK-293FT/4R-tauTr细胞,用Western blots分析RIPA可溶性和不溶性tau的水平。RIPA不溶性tau的水平反映tau seeds的朊样活性,比较三代3R-tauTr和4R-tauTr seeds的朊样活性。7.用不同量的第四代的3R-tauTr seeds和4R-tauTr seeds分别处理HEK-293FT/3R-tauTr或HEK-293FT/4R-tauTr细胞,用Western blots分析RIPA可溶性、不溶性tau和磷酸化tau的水平,探讨IV-3R-tauTr seeds和IV-4R-tauTr seeds诱导对应tau的聚集能力及其磷酸化状态。8.用第四代3R-tauTr seeds、4R-tauTr seeds和AD O-tau处理HEK-293FT/3R-tauTr和HEK-293FT/4R-tauTr细胞,Western blots分析RIPA可溶性和不溶性tau的水平。探讨3R-tauTr和4R-tauTr seeds的交互诱导聚集作用。9.将tau seeds滴在覆盖碳的铜网上,用1%磷钨酸（phosphotungstic acid,PTA）负染,用透射电镜观察3R-tauTr seeds和4R-tauTr seeds的超微结构。结果:1.在培养的细胞中用AD O-tau诱导4R-tauTr的RIPA不溶性4R-tauTr,能进一步诱导4R-tauTr的聚集。循环往复,产生的I、II代聚集的tau seeds均能诱导细胞产生RIPA不溶性tau的聚集体,因此4R-tauTr的聚集体可能具有朊样活性。2.反复冻融使得tau seeds诱导RIPA不溶性tau、不溶性磷酸化tau（p T217-tau）的水平明显减少,但可溶性tau、p T217-tau的水平没有明显不同。反复冻融的AD O-tau诱导聚集tau、磷酸化tau的水平没有明显不同。3.3R-tauTr和4R-tauTr在Thr181、Ser199、Thr212、Ser214、Thr231和Ser262位点的磷酸化水平相似,但4R-tauTr在Thr205和Thr217位点的磷酸化水平明显高于3R-tauTr.4.4R-tauTr比3R-tauTr更容易被AD O-tau猎获。5.在培养的细胞中产生的RIPA不溶性的3R-tauTr和4R-tauTr聚集体,可诱导相应tau的聚集,循环往复,诱导相应tau产生RIPA不溶性tau的能力不断增强。6.第一代到第四代seeds诱导相应tau聚集的能力不断增强,但第四代seeds冻融过1-2次,使得其诱导聚集的能力略有降低。与4R-tauTr seeds诱导4R-tauTr聚集比较,I-IV 3R-tauTr seeds诱导更多的RIPA不溶性3R-tauTr,提示3R-tauTr seeds朊样活性较高或3R-tauTr更容易被诱导聚集。7.3R-tauTr和4R-tauTr seeds剂量依赖性地诱导RIPA不溶性tau的聚集,聚集的tau在多个位点异常过度磷酸化。但tau seeds对RIPA可溶性tau和磷酸化tau的水平没有明显的影响。8.3R-tauTr seeds、4R-tauTr seeds和AD O-tau均可诱导4R-tauTr和3R-tauTr的聚集,3R-tauTr比4R-tauTr更容易被这三种tau seeds诱导聚集。AD O-tau和4R-tauTr seeds诱导生成的RIPA不溶性组分中检测到SDS-和β-ME抵抗的HMW-tau。9.经磷钨酸负染,在透射电镜上我们没有观察到3R-tauTr seeds和4R-tauTr seeds在超微形态上的明显不同。10.3R-tauTr seeds处理HEK-293FT/HA-3R-tauTr细胞,总tau和磷酸化tau的水平呈剂量依赖性增加,其中磷酸化Ser214和Thr217的水平大大高于tau水平的增加,磷酸化Thr205和Thr231的水平略高于tau水平的增加,磷酸化Ser199的水平与tau水平增加一致,提示3R-tauTr seeds可诱导tau位点特异性过度磷酸化。结论:1)在培养的细胞中产生的3R-tauTr和4R-tauTr聚集体具有朊样活性,诱导异常过度磷酸化的tau的朊样聚集,进一步支持截断触发tau的朊样激活;2)反复冻融使得tau seeds的活力降低;3)4R-tauTr比3R-tauTr更容易被AD O-tau猎获,但在培养的细胞中3R-tauTr比4R-tauTr更容易被朊样诱导聚集;4)3R-tau和3R-tau可以交互诱导聚集,聚集的4R-tauTr seeds可诱导SDS-和β-ME-抵抗的HMW-tau的产生;5)外显子10的编码产物R2在截断触发的朊样激活中有重要作用。