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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘产业中最具毁灭性病害之一,因其目前不能被有效治愈而被人们称之为柑橘的“癌症”。HLB在各大柑橘产区广泛蔓延,造成巨大的经济损失,有的地区的柑橘产业甚至被摧毁,该病严重威胁着全世界的柑橘产业。现在学术界广泛认可的引起该病的病原是一种革兰氏阴性菌,隶属于α-变形菌亚纲,韧皮部杆菌属的三个种:韧皮部杆菌亚洲种(’Candidatus Liberibacter asiaticus’,Las)、韧皮部杆菌非洲种(’Candidatus Liberibacter africanus’,Laf)和韧皮部杆菌美洲种(’Candidatus Liberibacter americanus’,Lam)。该病原菌是一种难培养细菌,至今仍无法被纯培养,一定程度上阻碍了对病原菌的深入研究。该病引起的主要症状包括:叶片的斑驳黄化;结果期出现的果实着色颠倒,即俗称所谓的“红鼻果”症状,严重影响着果实的质量和产量。在无抗性品种和有效的治愈方法的情况下,柑橘黄龙病的防控主要依赖于种植无病毒苗木、防治木虱、及时挖除病树。病害的早期诊断是至关重要的,然而由于田间诊断存在着主观误判性,所以现在运用最广的柑橘黄龙病的诊断技术是实验室分子检测技术。面对不断被报道出来的新的检测HLB的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)引物,筛选出灵敏度高、特异性强的引物,用于实验室检测HLB是非常必要的。本实验选取文献报道中常用的6对引物,结合常规PCR和荧光定量PCR(realtime fluores-cence quantitative PCR,q PCR),检测各对引物的灵敏度和特异性,结果如下:1、构建含有HLB病菌16S rDNA序列的重组质粒pT-16S,制备出与HLBarsp探针相应的荧光定量PCR的标准品,建立本实验室的荧光定量PCR检测体系。根据荧光定量PCR测定的阳性样品中的16S rDNA的量计算出柑橘黄龙病菌的含量,进而得到柑橘黄龙病菌基因组在叶片样品总核酸中占0.25%~0.35%。2、以文献报道中常用的5对常规PCR引物:OI1/OI2c、P400、P535、A2J5、Las606/LSS和本实验室设计的16S引物为实验组。结合荧光定量PCR技术,设计了6对引物的灵敏度检测实验和特异性检测实验,通过实验发现,检测核酸灵敏度顺序是Las606/LSS>16S>P400>OI1/OI2c=P535=A2J5,6对引物的特异性均较高,符合作为检测柑橘黄龙病引物的要求,其中最灵敏的Las606/LSS引物能够检测的柑橘黄龙病菌最低核酸量为9.0×10-3ng/μL。血清学法是病害检测方面运用较广的检测方法,在处理大量检测样品,快速检测方面具有优势。面对赣南地区HLB大面积传播,制备出适合赣南地区HLB病株的抗体,建立起血清学检测方法是非常必要的。本论文利用克隆和免疫学方法制备了HLB外膜蛋白(outer membrane protein,omp)抗体,取得成果如下:3、由于柑橘HLB外膜蛋白全长难表达,本研究对OMP基因进行分段表达。根据NCBI数据库中柑橘黄龙病外膜蛋白结构功能的预测,466-781aa片段是表面抗原位点,结合蛋白亲水性分析结果,选定OMP肽段C端对应的长1071bp处作为目的片段,对该目的片段进行克隆、诱导表达和多抗制备实验,ELISA法测定效价,最终得到效价≥1:512000的柑橘黄龙病菌的抗体。利用该抗体对采自田间的样品进行检测,结果发现该抗体能够检测出阳性样品,与普通PCR检测结果基本吻合,说明柑橘HLB外膜蛋白分段表达抗体制备成功,为后续实验室建立血清学检测方法奠定了基础。