冠心病是全球人类死亡的主要原因之一,同样也是消耗巨大医疗资源的疾病之一。经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)是目前治疗冠心病的重大进展之一,PCI手术已经广泛应用于冠心病患者的临床治疗,其临床疗效确切,可以明显改善患者的临床症状,同时提高患者的生活质量。但是,由于PCI手术过程中会对病变斑块的挤压、体内促凝组织的暴露以及支架等手术器械的置入,从而促进血小板的激活、血栓形成,引发支架内血栓,心肌梗死和死亡等临床终点事件。文献报道,每年有10%-15%的患者会出现等心脑血管事件,包括脑卒中和主要不良心脏事件(Major Adverse Cardiac Events, MACE主要包括心源性死亡、心肌梗死和再次血运重建)。因此,患者手术之后需要进行抗血小板治疗(同时服用阿司匹林和氯吡格雷),目前成为冠心病患者的一种常规治疗方法,改善患者的预后情况。但是进行抗血小板在临床上存在个体差异性,疗效不好(抵抗)可能会再次引起心肌梗塞,再住院甚至死亡。目前众多研究表明药物在体内的吸收、转化、处置等过程中涉及到的相关代谢酶以及转运体的基因多态性是主要原因。CYP3A是人类药物代谢的重要酶系,包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7,在体内表达量很高,但是不唯一,分布在肝脏和肠组织,参与45-60%的临床药物代谢。不同个体之间CYP3A的表达量和活性有很大的差异,高达60倍,可能会导致治疗失败、发生不可预测的不良反应以及药物毒性,在一定程度上是由于遗传因素和非遗传因素(激素／健康状况／环境因素)共同作用引起的。CYP3A活性的差异性可以解释90%个体之间不同的临床疗效。而氯吡格雷在体内的代谢主要经过两步代谢才可以转化为活性的代谢产物,第一步为氧化反应,生成2-氧-氯吡格雷,第二步为水解反应,生成活性代谢产物。体外研究表明,中间产物的产生过程由CYP2C19, CYP1A2和CYP2B6等催化,后一步由CYP3A4/5, CYP2B6, CYP2C19, CYP2C9催化。体内研究表明CYP3A4, CYP2C19和CYP1A2是原型药物代谢涉及的主要酶,这些代谢酶关乎到了体内氯吡格雷活性代谢产物的多少,从而表现出不同的临床效应。因此本研究拟在中国南方汉族人群中展开实验,首先建立检测CYP3A酶活性检测的方法；其次构建氯吡格雷体外代谢模型；最后探讨CYP3A4/5基因型对氯吡格雷活性代谢产物的血药浓度的影响,以及与血小板聚集率的相关性。第一章建立睾酮探针检测肝S9组分CYP3A酶活性的高效液相色谱法目的：建立以睾酮为探针测定人肝S9CYP3A酶活性的高效液相色谱法并运用该方法检测不同患者肝组织的CYP3A酶活性,为后续实验做好准备。方法：于2012年9月至2013年9月从孙逸仙纪念医院收集40例患者的正常肝组织,研磨低速离心制备肝S9组分。建立睾酮探针高效液相色谱法,以氢化可的松作为内标,选用Hypersil BDS C18分析柱(4.6mm×150mm,5μm),以甲醇：2mM磷酸二氢钾(52：48,V/V)为流动相,在245nm波长处检测经人肝S9孵育睾酮的主要代谢物6p-羟基睾酮的生成量,采用线性Lineweaver-Burk双倒数作图法研究肝CYP3A酶促动力学。结果：6p-羟基睾酮和睾酮的线性范围分别是0.5-32μg/mL和0.5-40μg/mL(分别为R2=0.9993, R2=0.9988),两者的最低定量限都为0.5ug/ml。方法回收率分别为96.8%-99.1%和96%-98.6%, RSD%<4.2;萃取回收率分别为90.3%-95.5%和91.5%-94.7%, RSD%<4.89,日内、日间精密度的RSD%<5,样本室温放置24h,稳定性良好,RSD%<5.2。肝CYP3A酶促动力学参数Km为41.19nmol/L, Vmax为625pmol/min*mg。结论：本实验建立的高效液相色谱法简单,稳定性好,可以体外评估CYP3A酶的活性。第二章CYP3A4/5的基因变异与肝S9组分CYP3A活性的相关性目的：细胞色素P450是重要的药物代谢酶,参与多种临床药物的生物转化。但是代谢酶活性个体差异较大,不同基因型,药物代谢速率不同。探讨CYP3A5*3基因变异和CYP3A4启动子区基因变异对肝S9组分CYP3A酶活性的影响。方法：于2012年9月至2013年9月从孙逸仙纪念医院收集40例患者的正常肝组织,采用TaqMan探针法检测CYP3A5*3的基因型,用PCR-测序法检测CYP3A4启动子区基因变异。采用睾酮探针高效液相色谱法(HPLC)检测CYP3A酶的活性,以6-OH睾酮与内标氢化可的松的峰面积之比代表CYP3A酶的活性。采用方差分析比较不同CYP3A5*3基因型间6-OH睾酮与内标氢化可的松的峰面积之比的差异。结果：40例肝组织,男26例,女14例,年龄的中位数是47.5. CYP3A5*3野生纯合型(*1/*1)27例(67.5%),突变杂合型(*1/*3)10例(25%),突变纯合型(*3/*3)3例(7.5%)；野生纯合型(*1/*1)和突变杂合型(*1/*3)的肝S9CYP3A酶活性均高于突变纯合型(*3/*3),野生纯合型(*1/*1)低于突变杂合型(*1/*3)；经过非参数检验分析：三组基因型之间的肝S9CYP3A酶活性有统计学差异(P<0.05)。非遗传因素分析：患者的性别、年龄、合并高血压或是服用质子泵抑制剂等因素对肝S9组分CYP3A酶的活性都没有显著性的影响(P>0.05)。在CYP3A4启动子区1kb内没有检测到基因变异。结论：CYP3A5*3突变显著影响肝S9组分CYP3A酶的活性,患者的性别、年龄、合并高血压或是服用质子泵抑制剂等对肝S9组分CYP3A酶的活性都没有显著性的影响；可能本部分研究样本量比较少,存在一定的局限性,实验结果还需进一步扩大样本进行验证。第三章CYP3A5基因变异与氯吡格雷抗血小板效应的相关性目的：使用氯吡格雷为基础的抗血小板治疗是经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后预防血栓事件的重要措施,但存在较大个体差异。研究发现CYP3A是氯吡格雷的主要代谢酶,在体内代谢过程中占到40%。本部分实验探讨CYP3A5基因变异对氯吡格雷抗血小板效应的影响,为今后基因导向的抗血小板药物的个体化用药提供理论依据。方法：从广东省人民医院入选106例首次负荷300mg氯吡格雷的冠心病患者,采集服药4h后的静脉血。应用TaqMan探针对106例患者进行CYP3A5*3基因分型检测,采用(液质联用)LC/MS方法检测氯吡格雷活性代谢产物(MP-H3/MP-H4)的血药浓度；运用VerifyNow-P2Y12系统检测血小板聚集率,评估氯吡格雷对血小板的抑制性。结果：1)106例患者中野生纯合型(*1/*1)59例(55.67%),突变杂合型(*1/*3)40例(37.73%),突变纯合型(*3/*3)7例(6.60%),携带等位基因*1的例数为99例(93.40%),不携带等位基因*1的例数为7例(6.60%)。2)建立的LC/MS方法：采用的乙腈蛋白沉淀法,MP-H3/MP-H4的提取回收率在80%以上,定量下限为0.2ng/mL,重线性好,稳定性好。3)体外代谢实验：40例肝组织标本中,CYP3A5野生纯合型(*1/*1)和突变杂合型(*1/*3)的MP-H3/MP-H4的浓度高于突变纯合型(*3/*3),经过非参数的检验分析得知,各基因型的药物浓度有统计学差异(P<0.05)。MP-H3/MP-H4的浓度与肝S9组分CYP3A酶活性呈现显著正相关(P<0.05),相关系数分别为0.413和0.435。4)体内代谢实验：106例冠心病患者中,CYP3A5野生纯合型(*1/*1)和突变杂合型(*1/*3)的MP-H3/MP-H4血药浓度略高于突变纯合型(*3/*3),经过非参数的检验分析得知,各基因型的血药浓度无统计学差异(P>0.05)。5)血小板反应值(PRU)：106例冠心病患者中,CYP3A5野生纯合型(*1/*1)的PRU为190±85,突变杂合型(*1/*3)的PRU为207±86,突变纯合型(*3/*3)的PRU为193±42,它们之间没有统计学差异。MP-H4在2h的血药浓度与血小板反应值呈现显著的负相关(P<0.05),相关系数为-0.327。6)106例冠心病患者的临床资料：冠心病患者的年龄和甘油三酯与血小板反应值PRU呈现显著的正相关(P<0.05),相关系数分别为0.256和0.202；而其他的临床资料(高密度脂蛋白、总胆固醇)不干扰PRU。结论：成功建立了LC/MS方法,可以准确的检测氯吡格雷活性代谢产物。CYP3A5*3基因变异对氯吡格雷活化代谢具有重要影响,但对抗血小板效应的影响受到临床复杂因素的稀释,并且年龄,高血脂都会增加血小板聚集率。本实验的结果,还需进一步扩大样本量进行验证。