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随着玻璃化冷冻技术的不断进步,玻璃化冷冻保存哺乳动物胚胎的效率越来越高。现有的玻璃化冷冻技术在保存哺乳动物早期胚胎时依旧存在很多问题,如冷冻效率不高,存在潜在的冷冻损伤等。本研究在已有的尼龙网玻璃化冷冻法的基础上,对小鼠早期卵裂阶段胚胎的玻璃化冷冻保存技术进行进一步优化,进行小鼠2-细胞胚胎的玻璃化冷冻保存研究,并进行大规模的批量化冻存小鼠2-细胞胚胎样本的探索,使每片尼龙网上冷冻保存的小鼠2-细胞胚胎达到100枚左右,以满足哺乳动物胚胎空间发育试验对早期卵裂阶段胚胎的批量需求。将玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎批量冻存／解冻后,再在实验室已经建立的密闭培养体系(地面模拟空间胚胎发育试验的培养条件)下培养,与新鲜胚胎密闭培养的结果进行综合比较,评估批量玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎的发育能力,探讨其是否可以满足哺乳动物空间胚胎发育试验的需要。为了更准确的评估批量玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎的质量,本研究还从胚胎细胞膜完整性、细胞骨架、线粒体分布、水通道蛋白的表达与分布等方面,探讨导致玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎体外发育率降低的原因。研究内容和结果如下：1.采用尼龙网玻璃化冷冻法,以EFS40作为玻璃化冷冻保护液——包含乙二醇(ethylene glycol,EG) (V/V) 40%,蔗糖(sucrose) 0.5 M和聚蔗糖(Ficoll 70) (W/V)25%,小鼠2-细胞胚胎在玻璃化冷冻保护液液中处理后,迅速加载到尼龙网上,然后浸没于装有液氮的冻存管中,置于液氮罐中冻存,每片尼龙网上加载约100枚胚胎。解冻时依次在0.5 M,0.25 M,0.125 M,0M的蔗糖溶液中处理,每个浓度的蔗糖溶液中平衡5 min,快速地脱除冷冻保护剂。解冻后小鼠2-细胞存活率为96.22±2.74%(1791/1857),其中完整胚胎(intact embryos, IEs)约占89.88±4.32%(1669/1857),部分完整胚胎(partial embryos, PEs)约占6.95±3.44%(122/1857)。因此,本研究采用的玻璃化冷冻方法可以用于批量冻存并获得批量存活的小鼠2-细胞阶段冷冻胚胎。2.小鼠2-细胞胚胎解冻后,将存活胚胎在常规微滴条件和密闭培养条件下体外培养,结果显示：玻璃化冷冻胚胎在不同培养体系条件下培养72 h、96h囊胚发育率,96h囊胚孵化率均低于新鲜胚胎组。其中玻璃化冷冻胚胎-密闭培养组的2-细胞胚胎培养72 h的囊胚发育率(90.86±1.43%)低于新鲜胚胎-密闭培养组(94.10±0.89%),但差异不显著；玻璃化冷冻胚胎-密闭培养组的2-细胞胚胎培养96h的囊胚发育率和囊胚孵化率(91.38±0.29%,32.02±2.30%)显著低于新鲜胚胎-密闭培养组(93.72±0.95%,39.02±2.99%)(P<0.05)。囊胚细胞计数结果显示,新鲜2-细胞胚胎体外培养72 h和96h后,囊胚细胞数与玻璃化冷冻胚胎体外发育到囊胚的细胞数之间差异不显著(P>0.05)。密闭培养的囊胚细胞数与常规微滴培养囊胚细胞数之间也无显著差异(P>0.05)。结果表明,玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎能够在密闭培养条件下正常发育到囊胚阶段,冷冻胚胎能够满足空间胚胎发育试验要求。3.尼龙网玻璃化冷冻的早期卵裂阶段小鼠胚胎体外发育率降低,可能是由于玻璃化冷冻-解冻过程对胚胎细胞造成了潜在损伤。因此,本研究从细胞膜完整性,细胞骨架,线粒体分布三个方面分析玻璃化冷冻-解冻过程对胚胎细胞造成的损伤。结果表明,相比于新鲜2-细胞胚胎,玻璃化冷冻-解冻的小鼠2-细胞胚胎细胞膜完整性未受到明显影响。冷冻-解冻后的胚胎,微丝骨架发生了变化,并且这种变化未能在体外培养中短时间恢复,但随着胚胎发育的进行,微丝骨架逐步得到恢复,微丝分布与新鲜胚胎基本一致；冷冻-解冻后的胚胎中纺锤体未见明显异常,与新鲜胚胎中的纺锤体形态结构一致。使用罗丹明123(Rhodamine123)检测冷冻-解冻胚胎线粒体分布时发现,部分解冻后的胚胎线粒体分布发生变化,在胚胎细胞的胞质中散乱分布,呈现无规则聚集状态；而新鲜胚胎中,线粒体均匀分布于胚胎细胞的胞质中,在细胞核周围呈现环绕聚集。这些结果证明,线粒体分布变化可能是导致胚胎发育率降低的主要原因,并因此推测早期卵裂阶段胚胎玻璃化冷冻-解冻过程可能导致胚胎细胞线粒体功能异常。4.为了进一步探讨卵裂阶段小鼠胚胎的玻璃化冷冻是否造成胚胎的其他损伤,本研究检测了小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻前后水通道蛋白3(aquaporin3, AQP3)和水通道蛋白7(aquaporin7, AQP7)在胚胎细胞的分布与表达。RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)检测结果显示,小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻前后均表达AQP3和AQP7基因。qRT-PCR (quantitative real time polymerase chain reaction)结果显示,玻璃化冷冻-解冻的小鼠2-细胞胚胎中AQP3 mRNA和AQP7 mRNA相对表达量相比于新鲜胚胎的表达量之间没有显著性差异(P<0.05)。免疫荧光检测结果显示,玻璃化冷冻前后小鼠胚胎AQP3蛋白主要分布于细胞质、细胞膜、核膜,这与新鲜2-细胞胚胎AQP3蛋白分布情况一致；AQP7蛋白主要分布在细胞质、细胞膜,玻璃化冷冻前后AQP7的分布未发生明显变化。蛋白质免疫印迹(Western Blot)结果也验证了上述结果,这两种水通道蛋白在蛋白质水平表达量未受到玻璃化冷冻-解冻的影响。