论文部分内容阅读
宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其中鳞状细胞癌约占85%,腺癌约占10～15%,鳞腺癌3%。目前认为,宫颈癌发生的主要危险因素是高危型人乳头瘤病毒持续感染,然而,肿瘤进展的机制错综复杂,宫颈癌发生发展的分子机制仍然未被完全明了。自噬是降解细胞中异常蛋白质、受损细胞器、外源微生物的进化上保守的依赖溶酶体代谢途径,是细胞再循环的分解代谢过程。微小RNA(microRNA,miRNA)作为一类小分子内源性非编码RNA,可在转录后水平调控基因表达,它可通过定位肿瘤相关基因组、调控表观遗传、加工相关基因及其蛋白等机制,参与肿瘤的发生发展过程。目前研究表明,miRNA靶向结合自噬相关基因,调控自噬的进程,参与多种恶性肿瘤的发病机制,如妇科恶性肿瘤,也包括其它肿瘤:肺癌、肝癌、乳腺癌等等。miR-1246与肿瘤关系的研究中,大多数认为它是一个癌基因miRNA,能促进肿瘤的发生发展。我们的前期研究发现:miR-1246能促进宫颈鳞癌SiHa细胞的生长和侵袭迁移,具有原癌基因作用,能加速宫颈鳞癌发展的进程。但是,miRNA作用于肿瘤发展过程的相关机制不是单一靶点和通路决定的,miR-1246在促进SiHa细胞的生长和侵袭的进程中,是否与调控自噬作用相关,目前还不清楚。在本研究中,我们筛选了miR-1246与自噬相关的靶基因生长阻滞特异性1(Growth Arrest Specific 1,GAS1)基因,并验证其结合具体靶点;通过验证miR-1246与GAS1对SiHa细胞的自噬作用,以及对细胞的生长和侵袭能力的影响,来证实miR-1246调控自噬可能是宫颈鳞癌发生、发展的分子机制之一;另外,我们还分析GAS1在宫颈鳞癌组织的表达,以及与临床病理因素、和预后的关系,初步探讨GAS1在宫颈鳞癌中的临床意义。本研究为miR-1246调控自噬参与宫颈癌进展的分子机制提供新的思路,也为制定以miR-1246及其靶基因GAS1为依据的靶向治疗方案提供新的理论依据。第一部分miR-1246调控宫颈癌SiHa细胞的自噬以及靶基因GAS1的验证目的:证实miR-1246调控宫颈癌SiHa细胞的自噬作用,以及明确靶基因GAS1。方法:运用 western blot检测 miR-1246 mimic、miR-1246 inhibitor、阴性病毒对照组(NC)、空白对照组(Blank),各组自噬关键蛋白LC3 Ⅱ、P62的表达情况;通过在荧光显微镜下观察计数GFP-LC3光点的数量,比较四组细胞自噬小体的数量;利用生物信息数据库预测miR-1246自噬相关靶基因,并在Pubmed、KEGG数据库里查询靶基因是否有自噬作用,挑选出目标靶基因,western blot检测miR-1246对靶基因蛋白表达的影响,再采用双荧光素酶法验证目标靶基因的具体结合靶点,回复实验验证GAS1是miR-1246的功能性靶基因。结果:与NC组相比,LC3Ⅱ的表达在miR-1246-inhibitor组下调(P=0.016)、miR-1246-mimic 组上调(P<0.001);而 P62 的表达则相反,miR-1246-inhibitor组上调(P<0.001)、miR-1246-mimic组下调(P=0.002);荧光显微镜下观察GFP的数量在miR-1246-inhibitor组减少(P=0.008)、miR-1246-mimic组增多(P=0.006)。根据生物信息数据库预测和Pubmed、KEGG里查询的结果,挑选GAS 1为目标靶基因;western blot检测结果显示miR-1246能下调GAS1的表达,双荧光素酶法证实GAS1上有miR-1246 的结合靶点;回复实验验证过表达 GAS1 能逆转上调 miR-1246 所诱导的自噬增强效应。结论:GAS1是miR-1246自噬相关靶基因,miR-1246通过结合GAS1上的位点,下调Gas1的表达,增强了SiHa细胞的自噬作用。第二部分GAS1调控自噬噬对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响目的:验证GAS1调控宫颈癌SiHa细胞的自噬作用,以及对SiHa细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法:运用western blot检测GAS1过表达组(LV-GAS1)、阴性病毒对照组(NC)、空白对照组(Blank),各组自噬关键蛋白LC3Ⅱ、P62的表达;通过共聚焦显微镜监控各组细胞自噬流的变化;采用透射电镜观察各组自噬小体或自噬囊泡的情况;利用CCK8增殖实验、划痕实验、Transwell迁移、侵袭实验验证GAS1对SiHa细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响;构建裸鼠移植瘤模型,分析、比较各组移植瘤生长曲线。结果:与NC组相比,P62的表达在LV-GAS1组上调(P=0.016),LC3Ⅱ的表达在LV-GAS1组下调(P=0.010),加入了氯喹(chloroquine)后,NC+chloroquine组较NC组LC3 Ⅱ的蛋白量显著增加(P<0.0001),而LV-GAS1+chloroquine组较LV-GAS1虽然也有所增加(P=0.002),但是增加的水平幅度较NC+chloroquine组明显减少;自噬流监控显示,LV-GAS1组较NC组自噬流明显减小(P=0.009);透射电镜显示,LV-GAS1组较NC组自噬小体数量明显减小(P=0.020)。细胞功能实验显示,LV-GAS1组较NC组细胞生长相对缓慢(P<0.001);24h、48H划痕愈合速度均明显下降(P<0.001,P<0.001);Transwell迁移、侵袭实验中细胞穿膜数明显减少(P<0.001,P<0.001)。裸鼠移植瘤实验中,LV-GAS1组较NC组肿瘤生长缓慢(P<0.001),肿瘤体积较小(P<0.001)。结论:GAS1抑制了SiHa细胞的自噬作用,同时抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭的能力。第三部分GAS1在宫颈鳞癌组织中的表达与临床意义目的:分析GAS1在宫颈鳞癌组织的表达,以及与临床病理因素、和预后的关系,初步探讨GAS1在宫颈鳞癌中的临床意义。方法:选取2013年7月至2016年6月间,广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科Ⅰa～Ⅱb期宫颈鳞癌组织标本72例,正常宫颈组织标本40例,运用qRT-PCR、免疫组织化学法分析标本中GAS1的表达情况,评估GAS1的表达和临床病理因素的关联性,以及与患者预后的关系。结果:GAS1 mRNA在宫颈鳞癌组织中的表达较正常宫颈组织中明显降低,P<0.001;宫颈鳞癌组织GAS1蛋白高表达率较宫颈正常上皮的高表达率明显下降,P<0.001;GAS1的表达与肿瘤大小(P=0.038)、宫颈间质浸润深度(P<0.001)、淋巴脉管间隙浸润(LVSI)(P=0.026)、淋巴结(LN)转移(P=0.010)、宫旁浸润(P=0.015)有一定关联性;GAS1低表达患者的DFS(P=0.029)和OS(P=0.046)均低于GAS1高表达患者;GAS1联合淋巴结评估预后,GAS1-和LN+组的患者DFS和OS最低,GAS1+和LN+/GAS1-和 LN-组次之,GAS1+和 LN-组 DFS 和 OS 最高(P=0.004,P=0.018);GAS1联合LVSI评估预后,GAS1-和LVSI+组的患者DFS最低,GAS1+和 LVSI+/GAS1-和 LVSI-组次之,GAS1+和 LN-组 DFS 最高(P=0.039);各组OS则没有统计学差异(P=0.103)。结论:GAS1在宫颈鳞癌组织中的表达要低于正常宫颈组织,而且与部分临床病理因素有相关性;低表达GAS1的患者相对高表达GAS1的患者预后较差,GAS1联合淋巴结、LVSI评估预后能加强评估效能。