研究背景：结肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤,随着我国经济水平的提高和人民群众膳食结构的变化,其发病率呈现逐年升高的趋势。传统的外科手术虽然是治疗结肠癌的最有效手段,但由于结肠癌发病的隐匿性和症状的不典型性,很多患者就诊时已达中晚期,错过了手术治疗的最佳时机。因此,化疗成为了中晚期结肠癌首选辅助治疗方案。遗憾地是化疗会产生严重的毒副反应,患者不易耐受。如何在确保治疗效果的前提下减少不良反应,是当前和今后一段时间内治疗中晚期结肠癌的研究热点。在此背景下,传统中医中药所具有的抗癌作用强、不良反应小、患者易耐受的特点逐渐受到了人们的重视。去甲斑蝥素(Norcantharidin, NCTD)是中药斑蝥的提取物。国内多家医院临床观察证实,将NCTD和常规化疗方案联合应用治疗晚期结肠癌与单独化疗相比,不但近期疗效好,不良反应轻,而且中位生存时间延长,生活质量明显提高。NCTD已经成为晚期结肠癌一线化疗的最优辅助用药。NCTD如何发挥抗癌作用,目前虽有各种解释,但尚无决定性结论。整合素是一类细胞表面黏附因子,由α和β两种亚基通过非共价键连接而成,构成了细胞外基质与细胞内骨架蛋白之间结构与功能的桥梁。αvβ6是一种特殊的整合素亚型,在健康人上皮组织中不表达或极少量表达,但在胚胎形成、损伤修复和一系列上皮来源的恶性肿瘤中呈现高表达状态。目前,关于整合素αvβ6在恶性肿瘤发生发展过程中的生物学作用研究取得了丰硕的成果,尤其是在结肠癌研究方面更加突出。已有文献报道,整合素αvβ6可以促进结肠癌细胞增殖、侵袭,诱导其抵御凋亡,增强癌细胞成瘤能力,对结肠癌的恶性进展具有明显的调控作用。我们前期实验证实,NCTD具有抑制结肠癌细胞表达整合素αvβ6的药理作用。本研究(第一部分)是在前期实验的基础上深入探讨NCTD抑制结肠癌细胞生长的具体机制,并为根据此药理机制开发新型靶向药物提供理论依据。一直以来,关于肿瘤的起源问题,医学界始终存在两种理论：随机理论认为所有肿瘤细胞的形状、大小及体积都是相同的,任何一个瘤细胞都可分化形成新的肿瘤,但其发生过程是一些低概率的随机事件。等级理论则认为,在所有肿瘤细胞中只有极其少量的细胞可以分裂形成新的肿瘤。这些少量的具有可分裂增殖能力的细胞被称为肿瘤干细胞。它具有自我更新和分化能力,是肿瘤不断生长、侵袭迁移的根源。目前肿瘤干细胞理论得到了越来越多的实验结果支持。结肠癌干细胞是消化系统恶性肿瘤中第一个被发现的肿瘤干细胞。按照肿瘤干细胞理论,肿瘤组织中干细胞的持续存在与肿瘤的恶性程度及预后密切相关；肿瘤干细胞大多处于G0／G1静止期,对化疗药物的耐受性远强于快速增殖期的其它肿瘤细胞；肿瘤干细胞所特有的成瘤能力是恶性肿瘤复发转移的重要因素。结合我们前期在组织学、细胞学、动物实验中的研究发现,表达整合素αvβ6的结肠癌细胞表现出的抵御凋亡、增殖侵袭和成瘤能力与肿瘤干细胞的强耐药性、无限增殖、高致瘤性等特性相一致。本研究(第二部分)初步探讨整合素αvβ6在结肠癌干细胞上的表达情况,明确其作为结肠癌干细胞新型表面标记的可能性,为分选、鉴定并深入研究该类细胞的特性奠定坚实的基础。第一部分去甲斑蝥素通过αvβ6-ERK信号通路诱导HT-29结肠癌细胞凋亡的实验研究目的研究去甲斑蝥素(Norcantharidin, NCTD)诱导结肠癌细胞凋亡的药理学机制。方法利用MTT法检测NCTD对结肠癌HT-29细胞生长的抑制效应；明胶酶谱分析NCTD对结肠癌HT-29细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs)量的影响；Biotrak MMPs活性检测NCTD处理后结肠癌细胞分泌的MMPs活性变化；Hoechst 33258荧光染色检测NCTD处理后结肠癌细胞凋亡程度；流式细胞检测NCTD对结肠癌细胞表面多种整合素表达情况的影响；MTT检测多种功能性阻抗对NCTD处理后HT-29细胞生长的影响；Western blotting分析NCTD对HT-29细胞内各种丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)表达量及磷酸化程度的影响；MTT检测多种MAPK抑制剂对NCTD处理后HT-29细胞生长的影响；免疫共沉淀实验检测NCTD对αvβ6-ERK直接连接的影响。结果NCTD能明显抑制人结肠癌HT-29细胞生长,且这种抑制效应与药物浓度和作用时间正相关；NCTD能够抑制HT-29细胞MMP-9分泌及活性,但对MMP-3无明显抑制效应；NCTD能够诱导HT-29细胞凋亡,60μmol/L NCTD处理12小时,细胞凋亡率即达35.6%；流式细胞分析表明NCTD能抑制结肠癌细胞表面整合素αvβ6的表达,但对αvβ3、αvβ5的表达无明显影响,进一步Western blotting分析显示,仅有p6亚基蛋白含量明显降低,αv、β3、β5亚基蛋白含量未见明显变化；MTT实验证实αvβ6功能性阻抗10D5能够增强NCTD抑制结肠癌HT-29细胞生长的效应,整合素αvβ3、αvβ5的单克隆抗体LM609和F1P6无明显抑制细胞生长的能力；Western blotting分析证实,HT-29细胞经NCTD处理后仅有磷酸化-ERK含量随NCTD浓度增加或作用时间延长而逐渐降低,细胞内ERK、JNK、p-JNK(磷酸化.-JNK)、P38和p-P38(磷酸化-ERK)水平无明显变化；ERK抑制剂PD98059能明显抑制结肠癌HT-29细胞的生长,而JNK抑制剂(SP600125)和P38抑制剂(SB203580)则无此抑制效应；免疫共沉淀证实NCTD干扰αvβ6-ERK直接连接的形成。结论NCTD通过降低HT-29细胞表达整合素αvβ6,阻碍了ERK的磷酸化过程,从而干扰αvβ6-ERK直接连接形成,阻断了αvβ6介导的恶性生物学信号向胞内的传导,最终达到诱导HT-29细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长的作用。意义揭示了NCTD诱导结肠癌细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长的具体机制,进一步证实了整合素αvβ6及avp6-ERK直接连接在调控结肠癌细胞恶性生物学行为中的作用,为今后针对αvβ6或avp6-ERK直接连接开展靶向治疗提供了确切的理论依据。第二部分整合素αvβ6在结肠癌干细胞向高侵袭性结肠癌细胞分化中的作用研究目的阐明整合素αvβ6的表达与结肠癌干细胞的相关性,并探索其在调控结肠癌干细胞向高侵袭性结肠癌细胞分化过程中的作用。方法免疫组化分析整合素αvβ6和结肠癌干细胞表面标记分子CD133在结肠癌肿瘤组织中的表达相关性；流式细胞分析HT-29结肠癌细胞中表达CD133阳性表达的细胞数,并利用CD133分子的单克隆抗体ANC9C5分选CD133+ HT-29细胞。将分选后的CD133+结肠癌细胞置于无血清培养基中孵育,并观察结肠癌干细胞形态学特征。利用siRNA技术干扰CD133+结肠癌细胞中β6基因的表达后,进行MTT实验观察αvβ6的表达对结肠癌细胞生长增殖的影响,明胶酶谱分析检测αvβ6的表达对结肠癌细胞分泌MMP-9的影响。结果免疫组化染色证实,结肠癌组织中整合素αvβ6和CD133的表达具有明显的一致性。其阳性表达率大致相等,并均在肿瘤边缘高表达,中心低表达。对细胞行流式分析证实,HT-29结肠癌细胞中CD133阳性表达率为1.6%,利用抗CD133分子的单克隆抗体ANC9C5分选HT-29细胞后,富集的CD133+HT-29结肠癌细胞达92.6%。将分选后的CD133+HT-29结肠癌细胞置于无血清培养基中孵育,细胞在72小时后能形成明显的肿瘤细胞球,呈现出典型的干细胞特征。在无血清培养基中加入胎牛血清后,肿瘤细胞球逐渐消失,瘤细胞再次贴壁生长,符合已分化肿瘤细胞特征。构建表达anti-p6 shRNA的质粒,并将其导入CD133+HT-29结肠癌细胞后,行RT-PCR和Western Blotting分析证实,(αvβ6 mRNA和蛋白表达水平明显减低。MTT检测证实(αvβ6+ CD133+ HT-29结肠癌细胞在无血清培养基中能正常分裂增殖,而(αvβ6- CD133+ HT-29细胞则几乎无增殖。明胶酶谱分析也证实(αvβ6+ CD133+ HT-29结肠癌细胞分泌MMP-9水平明显高于(αvβ6- CD133+ HT-29细胞。结论整合素αvβ6和CD133分子在结肠癌肿瘤组织中共表达、共定位。整合素αvβ6能够促进CD133+的HT-29结肠癌细胞增殖生长,并诱导其分泌MMP-9,在调控结肠癌干细胞向高侵袭结肠癌分化中发挥了关键作用。意义揭示了整合素αvβ6调控结肠癌干细胞向高侵袭结肠癌分化中的关键作用。由于肿瘤组织边缘富集高侵袭力的结肠癌细胞,因此整合素αvβ6也可以作为一种高侵袭性结肠癌细胞的一种分子标记。