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流行病学研究提示:肥胖、糖尿病与胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PDAC)的发生存在紧密联系。一项Meta分析显,按2型糖尿病(type 2 diabetesmellitus,T2DM)患者不同病程1年、1-4年、5-9年、10年以上分析,患PDAC 的相对危险度(relative risk,RR)分别为 5.38、1.95、1.49、1.47。T2DM 是一组由胰岛素抵抗引起胰岛β细胞过度分泌胰岛素导致的以高血糖和高胰岛素血症为主要特征的临床症候群。T2DM导致PDAC的机制尚不完全清楚,目前针对胰岛素在PDAC发生发展中作用的研究主要集中在其对肿瘤细胞的增殖及存活效率方面的影响,而对胰腺基质细胞的影响关注甚少。胰腺纤维化是PDAC的病理特征之一,其中负责产生大量纤维基质反应的是活化的胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell,PaSC)。我们的前期研究表明,高脂饮食诱导的Kras基因突变的PDAC小鼠模型体内可见血糖和胰岛素水平明显增高以及胰腺组织中大量活化的PaSC。本研究主要探讨高浓度的胰岛素和葡萄糖对人和小鼠PaSC活化、增殖和促纤维化反应方面的影响及其相关信号传导通路。第一部分2型糖尿病患者及高脂喂养小鼠胰腺中存在活化的胰腺星状细胞及大量胶原蛋白沉积目的:明确T2DM患者及高脂喂养小鼠胰腺纤维化的程度以及PaSC的分布及活化情况。方法:(1)收集非糖尿病和T2DM患者捐赠的胰腺组织各3例(女性,年龄范围:52-57岁),经4%多聚甲醛固定,石蜡包埋(formalin-fixed,paraffin-embedded,FFPE)后行4 μm连续切片。石蜡切片行马松染色(Masson’s staining)和免疫荧光双标染色(PaSC marker/α-SMA,pancreatic β cell marker/insulin),观察T2DM患者胰腺组织中胶原蛋白(Collagen,Col)沉积以及PaSC的分布,评估T2DM患者胰腺纤维化和PaSC活化情况。(2)选取6周龄雌性C57BL/6小鼠共40只,随机分为两组:普通饲料(control diet,CD)饲养的对照组和高脂、高热量饲料(high fat,high calorie,HFCD)饲养的实验组,每组各20只,再分为四亚组,每亚组各5只,分别饲养3、6、9和12月后取各组小鼠的胰腺组织制备4 謬m的石蜡切片,行天狼星红(sirius red)染色及免疫荧光双标染色(PaSC marker/α-SMA,pancreatic β cell marker/insulin),评估 HFCD喂养小鼠胰腺纤维化的程度以及PaSC活化情况。结果:(1)Masson’s染色结果显示:非糖尿病患者的胰腺形态正常,胶原纤维主要局限分布在血管周围。与非糖尿病患者相比,T2DM患者胰腺中可见大量蓝色胶原纤维,且不仅在血管周围,在胰岛内以及胰岛周围均可见大量胶原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ,Col Ⅰ)沉积,T2DM患者胰腺组织胶原蛋白沉积的量约是非糖尿病患者的3倍;免疫荧光染色结果显示:非糖尿病患者胰腺中PaSC活化标志物α-SMA+细胞较少,且主要局限在血管周围,但T2DM患者胰腺中α-SMA+细胞较对照组明显增加,且主要分布在insulin+的胰岛β细胞周围。(2)Sirius red染色结果显示:HFCD喂养12月的小鼠胰腺出现轻微的纤维化和胰岛细胞肥大,与对照组小鼠胰腺组织中胶原蛋白多沉积于血管周围不同,HFCD组小鼠胰岛及邻近腺泡细胞周围均可见大量Col Ⅰ沉积。且胰腺组织Col Ⅰ沉积量也随HFCD喂养时间的增长而明显增加。同期的免疫荧光染色也得到了与Sirius red一致的结果,HFCD喂养小鼠的胰岛内存在大量α-SMA+的活化PaSC。结论:本课题首次在T2DM患者和HFCD肥胖小鼠模型的胰腺中发现活化的PaSC,为"T2DM和肥胖为PaSC活化和纤维基质反应提供微环境"的假说提供了新证据,也为后续进一步研究高糖、高胰岛素的T2DM环境对PaSC活化、增殖和功能等生物学特性的影响及其相关信号通路提供了依据。第二部分人和小鼠胰腺星状细胞的分离鉴定以及高糖、高胰岛素对胰腺星状细胞活化、增殖和功能的影响目的:分离、培养并鉴定小鼠原代PaSC。观察PaSC上胰岛素受体的表达情况。观察高浓度胰岛素与高糖对PaSC活化、增殖及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成等生物学特性的影响及其相关信号传导通路。方法:(1)取人及小鼠新鲜胰腺组织用于PaSC细胞的分离。对传代培养的第二代PaSC行免疫荧光染色,鉴定PaSC特征性标志物(α-SMA,Desmin,Vimentin),ECM 蛋白成分[collagen Ⅰ,collagen Ⅲ,纤维连接蛋白(fibronectin,FN)]。(2)用新鲜分离的小鼠原代胰腺星状细胞(mouse primary pancreatic stellate cell,mPaSC)行蛋白印迹试验(western blot,WB)及实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR,qPCR)检测明确 PaSC 上胰岛素受体(insulin receptor,IR)和胰岛素样生长因子-1 受体(insulin-like growth factor receptor,IGF-1R)的表达。(3)qPCR检测高浓度胰岛素在高糖环境下对PaSC活化的影响。(4)WB检测高浓度胰岛素单独或联合高糖对PaSC上IR/IGF-1R的激活以及下游信号分子(AKT,mTOR,P70S6K,ERK,JNK)的活性。(5)qPCR和MTT法分别检测高浓度胰岛素单独或与高糖联合作用对已活化PaSC增殖及ECM蛋白合成的影响。结果:(1)免疫荧光染色鉴定分离得到的PaSC,传代后胞内脂质消失,表达星状细胞标记物 α-SMA,Nestin,Vimentin,并高表达 ECM(collagen Ⅰ,collagenⅢ,fibronectin)。(2)蛋白印迹实验及qPCR结果均证实PaSC同时高表达IR(主要表达IR-A亚型)和IGF-1R受体,且IR和IG-1R的表达量在PaSC静息和活化状态下无明显差异。以不同胰岛素浓度(25-100 nM)刺激PaSC,24 h可见IR和IGF-1R水平均随胰岛素浓度梯度升高而明显下调,48 h恢复至对照组水平。(3)qPCR结果显示:与10%FBS的阳性对照相比,高糖、高胰岛素作用下的PaSC并未出现细胞数量和α-SMA+细胞的增多,提示高浓度胰岛素对PaSC活化无明显影响。但在高胰岛素的刺激下,已活化的PaSC合成Col和FN等ECM蛋白的能力明显高于对照组[Col:(1.61±0.12)vs.(1.000±0.03),p<0.05;FN:(1.72±0.04)vs.(1.000±0.06),p<0.05]。(4)WB 表明,不同浓度梯度的胰岛素可诱导PaSC表面IR/IGF-1R的磷酸化,且100 nM的胰岛素诱导的IR/IGF-1R磷酸化水平最强,为对照组的7.4倍(p<0.05)。IR/IGF-1R的磷酸化还可导致下游MAPK/ERK和AKT/mTOR信号通路的激活。与ERK1/2和SAPK/JNK在高浓度胰岛素处理后出现的快速而短暂的磷酸化水平增加相比,AKT/mTOR通路的激活强效而持久。此外,胰岛素单独或与高糖联合作用于PaSC1、3、6 和 24h,均可引起 IR/IGF-1R,AKT,P70S6K,ERK1/2 不同程度的蛋白磷酸化水平升高,且与高糖联合作用下,上述蛋白的磷酸化水平升高更为明显。(5)已活化的PaSC受高糖、高胰岛素单独或联合作用刺激48h,qPCR结果显示:与对照组相比,高糖、高胰岛素均可一定程度地提高PaSC合成ECM蛋白的能力,FN和ColⅠ的mRNA水平较对照组明显升高,且高糖,高胰岛素联合作用的增强效果更明显[FN:(1.85±0.10)vs.(1.000±0.13),p<0.05;Col:(1.74±0.08)vs.(1.000±0.07),p<0.05]。但无论是高糖亦或是高胰岛素对α-SMA的mRNA水平均无明显影响。MTT结果显示:高糖、高胰岛素单独刺激72h,PaSC细胞增殖的数量是对照组的1.8倍(p<0.05),而两者联合作用下的细胞增殖量是对照组的2.7倍(p<0.05)。结论:PaSC高表达IR和IGF-1R受体,且两者的表达量在PaSC静息和活化状态下无明显差异。高浓度的胰岛素可与IR/IGF-1R结合,使受体磷酸化,并激活下游AKT/mTOR和MAPK/ERK两条重要信号通路,促进已活化PaSC细胞的增殖和合成ECM蛋白的能力,但无论是高浓度的胰岛素还是高糖对PaSC的活化无明显影响。第三部分mTOR通路阻断剂(KU 63794)对胰岛素诱导的胰腺星状细胞功能和增殖的影响目的:在第二部分实验中,我们已观察到胰岛素能够诱导PaSC表面IR/IGF-1R受体磷酸化以及AKT/mTOR和MAPK/ERK重要信号通路的激活。且胰岛素对AKT/mTOR信号通路的激活比MAPK/ERK更为持久和显著,为了进一步阐述AKT/mTOR信号通路在胰岛素诱导的PaSC增殖和促纤维化反应中的作用,我们选择mTOR复合物1(mTOR complex 1,mTORCl)和mTOR复合物2(mTOR complex 2,mTORC2)的小分子选择性阻断剂KU 63794(KU),观察其对AKT/mTOR信号通路以及PaSC增殖与合成ECM相关蛋白的影响,并分析相关的分子机制。方法:小鼠胰腺星状细胞细胞系(immortalized mouse PaSC,imPaSC)分别用mTOR阻断剂KU(1 謬M)或新鲜的无血清培养基预处理1 h,(1)用胰岛素(100 nM)干预15 min-48 h,通过WB分析KU对imPaSC下游信号通路活性的影响。(2)用胰岛素(100nM)干预48h,通过WB检测KU对imPaSC合成ECM蛋白能力的影响。(3)用胰岛素(100 nM)干预48 h或96 h,通过MTT法检测KU对imPaSC增殖能力的影响。结果:(1)WB结果表明,以1μM KU阻断mTOR通路,能够完全抑制imPaSC由胰岛素诱导的P70S6K蛋白在Thr 389位点的磷酸化,且这种抑制作用可持续至少48 h,同时能显著降低AKT在Ser 473的磷酸化水平。但p-ERK1/2与对照组相比无明显变化。(2)WB结果显示,与对照组相比,KU(1謬M)预处理imPaSC,能够几乎完全抑制胰岛素诱导的FN,Col Ⅰ以及4-羟化酶 α2(the alpha subunit 2 of prolyl 4-hydroxylase,P4HA2)蛋白水平的增加(p<0.05)。与此相反的是,无论是高浓度的胰岛素(100 nM)还是KU(1 謬M)对PaSC活化标志物α-SMA蛋白的表达量均无影响。(3)MTT结果显示,与对照组相比,KU能显著降低imPaSC由胰岛素诱导的增殖能力。结论:阻断mTOR通路可显著降低imPaSC由胰岛素诱导的细胞增殖和ECM合成能力,同时伴随AKT/mTOR信号通路的下调。