在氮污染废水处理技术中,微生物修复具有绿色环保、高效经济等优点,尤其是发现好氧反硝化细菌以后,微生物脱氮技术得到了快速发展,采用好氧反硝化微生物进行生物脱氮处理废水具有许多新的优势,如:（1）生长繁殖快、代时短、培养成本低;（2）有的好氧反硝化细菌能进行同时硝化与反硝化作用,因此,无需额外添加酸碱调节剂;（3）能同时去除多种无机氮等。然而,微生物脱氮过程复杂,不同微生物的脱氮途径有很大差异,目前,对于耐冷微生物的脱氮途径研究缺乏;其次,微生物脱氮会受到许多环境因素的影响,金属离子普遍存在于废水中,不同金属离子对生物脱氮过程的影响系统性研究较少,尤其是对耐冷微生物的影响研究更为缺乏。本文建立在已分离筛选获得的耐冷好氧反硝化菌株Arthrobacter arilaitensis Y-10的基础上,分别研究了耐冷菌株Y-10的脱氮特点及途径,在不同金属离子冲击下的脱氮效率及金属离子对其脱氮影响的机理,主要结果如下:1.在15℃条件下,采用模拟废水研究了菌株Arthrobacter arilaitensis Y-10的脱氮特点。结果表明,铵态氮是最有利于菌株Y-10进行生物脱氮的无机氮。在异养硝化过程中,铵态氮的去除效率可达100%。在同时硝化与反硝化过程中,铵态氮能促进硝态氮的还原。在好氧反硝化过程中,以硝态氮为唯一氮源时,硝态氮的去除效率仅为73.3%。加入等量的铵态氮后会显著提高硝态氮的去除效率,如在铵态氮和硝态氮各5 mg/L的混合氮源中,硝态氮的去除效率可显著增加至85.3%;当铵态氮和硝态氮分别增加至100 mg/L的混合氮源时,硝态氮的去除效率可高达100%。在低浓度的铵态氮和硝态氮混合氮源中只积累了0.02 mg/L的亚硝态氮;在高浓度的铵态氮和硝态氮混合氮源中会产生大量的亚硝态氮积累,最高可达122.23 mg/L。当以初始浓度为10.31 mg/L的亚硝态氮为唯一氮源时,亚硝态氮的去除效率可达100%,在该过程中既不会有铵态氮的产生,也不会有硝态氮的积累。综上所述,菌株Arthrobacter arilaitensis Y-10在15℃条件下能单一地去除铵态氮、硝态氮和亚硝态氮,也能进行同时硝化和反硝化作用去除铵态氮与硝态氮、铵态氮与亚硝态氮混合氮源。2.通过对耐冷菌株Arthrobacter arilaitensis Y-10脱氮中间产物、脱氮酶活性、胞外及胞内亚硝态氮积累等分析,推测该菌的生物脱氮过程。结果表明,以铵态氮为氮源进行异养硝化时,胞外能检测到羟氨的产生,但无亚硝态氮积累,以羟氨为氮源时,胞外产生了0.65 mg/L亚硝态氮的积累。在好氧反硝化过程中,以初始浓度为101.04 mg/L的硝态氮为唯一氮源时,胞外积累了43.66 mg/L亚硝态氮。当以100.03 mg/L的亚硝态氮为氮源时,胞外可检测到2.15 mg/L的铵态氮积累。对氮转化过程中酶活测定发现,氨单加氧酶（AMO）、羟氨氧化还原酶（HAO）和硝酸盐还原酶（NR）的比活分别为0.42、0.0014和0.0049 U/mg蛋白质。此外,亚硝酸盐还原酶能被二乙基二硫代氨基甲酸盐（DDC）完全抑制。在氮转化实验过程中,无论是以有机氮（Luria-Bertani medium LB）为氮源还是以铵态氮、硝态氮或亚硝态氮为单一氮源,均能在胞内检测出大量亚硝态氮积累,积累的亚硝态氮浓度分别为43.0、42.26、39.94和35.01 mg/L,对应的蛋白质浓度分别为532.30、537.15、741.54和718.54 mg/L,因此,胞内亚硝态氮占细胞蛋白质浓度的百分比分别为8.08、7.37、5.38和4.87,这表明以LB为氮源时,胞内亚硝态氮的积累量最大,以铵态氮、硝态氮和亚硝态氮为单一氮源的胞内亚硝态氮积累量呈依次递减趋势。迄今为止,还没有明确的生物化学机制能解释高浓度亚硝态氮积累在胞内的现象。对于菌株Arthrobacter arilaitensis Y-10进行异养硝化和好氧反硝化过程中温室气体CO₂和N₂O释放量的研究结果表明,分别以铵态氮、硝态氮和亚硝态氮为氮源时,产生CO₂的量分别为79.68、74.78和67.18 mg/L,产生的N₂O浓度分别为0.06、0.08和0.84 mg/L。由此可看出,产生的N₂O浓度显著低于CO₂浓度,表明菌株Y-10在生物脱氮过程中产生的氮氧化物对温室气体贡献小,在实际应用过程中比较安全。结合脱氮中间产物、硝化与反硝化抑制剂对生物脱氮过程的影响作用、总氮的去除量及N₂O的产生,推测菌株Y-10进行异养硝化脱氮的途径为:铵态氮→羟氨→亚硝态氮→气态氮,好氧反硝化途径为:硝态氮→亚硝态氮→气态氮。且明确N₂O不是菌株Y-10进行生物脱氮的主要产物。3.研究了碱土金属[Ca（Ⅱ）、Mg（Ⅱ）]和重金属[Zn（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）]离子对菌株Arthrobacter arilaitensis Y-10生物脱氮能力的影响。实验结果表明,菌株Y-10能耐受20 mg/L的Ca（Ⅱ）,在该条件下对铵态氮的去除效率可达100%。以亚硝态氮为唯一氮源时,添加0.5 mg/L的Ca（Ⅱ）能显著提高总氮的去除效率。添加Mg（Ⅱ）能显著提高微生物的生长速率和脱氮效率。当Mg（Ⅱ）浓度由0增加至2 mg/L时,铵态氮、硝态氮和亚硝态氮的去除效率分别增加了40.62%、69.91%和64.68%。然而,菌株Y-10的脱氮能力会受到重金属Zn（Ⅱ）和Ni（Ⅱ）的显著抑制作用。尽管如此,当Zn（Ⅱ）浓度高达30 mg/L时,氮的去除依然能持续进行。但添加8 mg/L的Ni（Ⅱ）时,铵态氮和总氮的去除几乎停止。添加1 mg/L的Ni（Ⅱ）时,菌株Y-10反硝化脱氮能力完全消失。总体表明,碱金属Ca（Ⅱ）和Mg（Ⅱ）,尤其是Mg（Ⅱ）,比重金属Zn（Ⅱ）和Ni（Ⅱ）更有利于提高菌株Y-10的脱氮效率。4.采用非竞争性抑制模型评估铜离子对菌株Y-10去除铵态氮、硝态氮和亚硝态氮的影响。结果表明,铜离子对菌株Y-10去除铵态氮、硝态氮与亚硝态氮的影响趋势基本一致。添加0.25 mg/L的铜离子均能显著提高菌株Y-10去除铵态氮、硝态氮和亚硝态氮的能力。通过改进的非竞争性抑制模型拟合表明,铜离子影响菌株Y-10去除硝态氮和亚硝态氮的半抑制浓度分别为0.195和0.090 mg/L。更为特别的是,添加微量的镁离子可显著提高菌株Y-10的生长速率、氮的去除效率以及对铜离子的耐受性。5.研究了重金属Cd（Ⅱ）、Co（Ⅱ）和Mn（Ⅱ）离子对菌株Y-10异养硝化与好氧反硝化过程的影响。在不同重金属离子的冲击下,同时考虑菌株Y-10的脱氮效率和不同重金属离子影响菌株Y-10生物脱氮的半抑制浓度发现,金属离子对菌株Y-10的生长与脱氮能力的抑制强度顺序为Co（Ⅱ）>Cd（Ⅱ）>Mn（Ⅱ）。分别来说,当添加的Cd（Ⅱ）浓度低于2.5 mg/L时,对铵态氮的去除效率没有影响,其去除效率可达100%。当分别添加0.1和0.25 mg/L的Cd（Ⅱ）时,可提高硝态氮和亚硝态氮的去除效率,但高于0.25和0.5 mg/L的Cd（Ⅱ）会分别降低硝态氮和亚硝态氮的去除效率。与之不同的是,添加Co（Ⅱ）会强烈抑制菌株Y-10的生物脱氮过程,尤其是对反硝化过程的影响更为强烈。在反硝化系统中只要添加Co（Ⅱ）,菌株Y-10的生长与生物脱氮过程则立即停止。对添加Mn（Ⅱ）而言,即使Mn（Ⅱ）浓度达到30 mg/L,对菌株Y-10去除铵态氮均无显著影响。添加0.5 mg/L的Mn（Ⅱ）还能显著提高硝态氮和亚硝态氮的去除效率。但继续增加Mn（Ⅱ）离子浓度会显著降低硝态氮和亚硝态氮的去除效率。所有结果表明,与异养硝化去除铵态氮相比,好氧反硝化过程对重金属Cd（Ⅱ）、Co（Ⅱ）和Mn（Ⅱ）的抑制作用更为敏感。6.利用转录组差异基因表达分析,研究锰离子对生物脱氮过程的影响机理。结果表明,无论是以铵态氮还是硝态氮为氮源,与对照组相比,添加锰离子后的处理组与氮代谢相关的基因均发生了明显差异性表达。以铵态氮为氮源时,差异表达基因被注释到GO数据库中与氮代谢相关的有6个基因sdaA、sugE、glnA、NirS、nirK和nirB分别上调了0.77、0.48、0.35、5.17、0.90和0.88倍,与氮代谢相关的另10个基因hutH、aspA、ilvA、amt、nadE、narG、narH、narJ、narI和nirD分别下调了1.77、1.24、1.06、1.02、0.52、2.01、1.80、1.41、1.36、1.33、1.00倍。但这些上调和下调的基因与铵态氮代谢没有直接的关联。在KEGG代谢通路中,仅被注释到的与硝化相关的基因NxrAB表现出了下调作用,余下与硝化过程相关的基因没有受到显著影响。在反硝化过程中,以硝态氮为氮源时,添加锰离子后,菌株Y-10有众多基因表达水平发生了变化,与氮代谢相关的上调基因种类和基因数量均高于下调的基因种类和数量。差异表达基因被注释到GO数据库中与氮代谢相关的10个基因amt、glnA、hutH、nadE、sdaA、sugE、nirB、nirD、nirS和NarK分别上调了3.07、1.82、1.73、1.72、0.67、0.38、3.25、1.84、0.86和0.83倍,与氮代谢相关的另7个基因aspA、glnA、ilvA、narI、narG、narH和narJ分别下调了1.98、0.73、0.68、0.79、0.67、0.41、0.34倍。在KEGG代谢通路中,与铵态氮氧化相关的所有基因包括AmoCAB、Hao和NxrAB均未受到影响,与硝态氮代谢相关的NasB、NirBD、NRT、narK、nrtP和nasA表现出了上调的作用,由于硝态氮转化的过程中会积累大量的亚硝态氮,而在研究亚硝态氮转化效率的实验中,发现亚硝态氮是可以被菌株Y-10继续还原的成气态氮的,在本实验中,亚硝酸盐还原酶基因nirB同样表现出了上调的作用。此外,谷氨酸合酶基因gltB和gltD也表现出了上调作用。综上所述,锰离子对菌株Y-10进行生物脱氮过程的影响主要是通过影响硝化与反硝化过程中基因的转录量来实现的,在反硝化过程中受影响的基因种类和数量比硝化过程中要多,这从基因水平上阐明了菌株Y-10的反硝化过程比硝化过程对金属锰离子的促进或抑制影响更为敏感。