论文部分内容阅读
多不饱和脂肪酸（polyunsaturate fatty acids, PUFAs）是人体必需的营养物质，ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3polyunsaturated fatty acids，ω-3PUFAs)是具有广泛生物学功能的多不饱和脂肪酸，在预防和治疗心脑血管等多种疾病方面有着重要作用。ω-6多不饱和脂肪酸（ω-6polyunsaturated fatty acids，ω-6PUFAs）和ω-3多不饱和脂肪酸二者含量的平衡对于机体的稳定和正常发育非常重要。人体自身缺少合成ω-3脂肪酸相应的酶类前体物，并且不能将ω-6PUFAs转化为ω-3PUFAs，目前，哺乳动物只能通过长期摄取富含ω-3PUFAs的食物来提高体内ω-3PUFAs的含量，并且来源相当有限。本试验将马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)的多不饱和脂肪酸去饱和酶基因根据哺乳动物的密码子偏好性和基因表达特征对其编码区（CDS,coding sequence）优化改造，从而获得基因片段，该基因编码区全长1086bp，编码362个氨基酸，对这两种基因进行同源性比较，分析其核苷酸序列的同源性为85.18%，编码的氨基酸序列没有发生改变。△17基因可以特异性的催化花生四烯酸（Arachidonic acid, ARA,20:4n-6）转化为二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid, EPA,20:5n-3）。将△17基因用限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入真核表达载体骨架pIRES2-AcGFP1，通过酶切验证和测序结果证明插入的序列正确，真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-△17构建成功。将载体pIRES2-AcGFP1和pIRES2-AcGFP1-△17通过脂质体介导的方法转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系并对其进行G418抗性筛选，获得了稳定表达的转基因细胞系。△17转基因细胞系的RT-PCR检测及脂肪酸组成的气相色谱分析表明，△17基因完全能够在CHO细胞中高效的异源表达并发挥其ω-3脂肪酸去饱和酶的作用。ARA作为底物添加到转基因细胞系中，与转染AcGFP1的CHO细胞相比，转染△17的CHO细胞中花生四烯酸（ARA，20:4n-6）的含量降低，由对照组的15.44%降低为11.72%，分析结果差异显著(p<0.05)，二十碳五烯酸（EPA，20:5n-3）的含量显著升高(p<0.05)，由3.77%升高为5.92%，由多个重复试验测得EPA的含量与对照组相比增加了86.5–246%(p<0.05)，ARA/EPA相对于对照组从4.09:1减低到1.98:1，这说明马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的优化是成功的，而且能够很好的发挥作用。本研究为进一步构建富含ω-3多不饱和脂肪酸的转基因动物模型以及研究该基因的功能提供了重要的理论基础。