麻竹转录因子D1SCL6和D1AP2功能研究及叶片miRNA的分离鉴定

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麻竹(Dendrocalamus latiflorus)是我国南方广泛栽培的重要竹种之一,具有食用、材用、绿化等多种用途,经济价值极高。植物基因的表达受到转录前、转录以及翻译水平等多个层的精准调控,研究竹子基因表达调控的机理对于深入了解竹子的生命现象,更好地开发利用竹子资源具有重要价值。转录因子参与基因转录水平的调控,miRNA参与转录后调控,二者都是植物基因表达调控的重要方式。本研究以麻竹为对象,针对SCL6和AP2这两个植物特有的转录因子进行了研究,同时开展了麻竹叶片miRNA的分析研究,并对其部分新miRNA的表达进行了分析探讨。主要研究成果如下:(1)利用RT-PCR和RACE方法,从麻竹叶片中克隆到与其生长发育密切相关的转录因子基因DlSCL6和DlAP2。DlSCL6基因cDNA全长2006bp,5′非编码区(UntranslatedRegions,UTR)124bp,3′UTR266bp,含有一个1611bp的开放阅读框(Open ReadingFrame,ORF),编码536个氨基酸;DlAP2基因cDNA全长1731bp,其中5′UTR81bp,3′UTR186bp,ORF1464bp,共编码487个氨基酸。(2)分别构建了DlSCL6基因的正义和反义表达载体,利用农杆菌介导法转化模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana),并对抗性植物进行RT-PCR鉴定,分别获得了DlSCL6基因的正义、反义转基因株系。对转基因植株表型观察显示,转正义DlSCL6基因植株营养期延长,开花延迟,植株粗壮高大,莲座叶数量增加;而转入反义基因的植株开花提前,植株瘦弱,且莲座叶数量明显减少。转反义DlSCL6基因植株表型与矮牵牛(Petuniahybrida)、拟南芥中ham基因功能缺失的表型类似,这意味着DlSCL6基因与拟南芥等植物中HAM亚家族基因具有类似功能,可能在竹子维持顶端分生组织分生活性中发挥重要作用。(3)将DlAP2基因构建到pCAMBIA1300载体的多克隆位点,形成DlAP2基因的过量表达载体,利用农杆菌介导法成功获得了转DlAP2基因的拟南芥植株,并利用RT-PCR方法证明DlAP2基因在转基因植株中稳定表达。与野生型拟南芥相比,转DlAP2基因植株开花提前,表明DlAP2可能具有促进麻竹开花的功能。(4)构建了麻竹叶片miRNA文库,利用Solexa高通量测序技术测序得到11513607条序列,去除低质量序列、5′端污染、3′端接头缺失、插入片段缺失、polyA片段以及小于18nt的序列后,得到干净序列(clean reads)10593305条。应用生物信息学分析技术预测得到165种候选的miRNA,其中与已知的其他物种miRNA同源性较高的保守miRNA有84种(其中miRNA54种,miRNA*30种),分别属于17个已知的miRNA家族;非保守的新miRNA共81种(其中miRNA76种,miRNA*5种)。搜索比对麻竹EST数据库和毛竹CDS数据库,对麻竹新miRNA的靶基因进行预测,得到靶基因176个,其中37个来自麻竹EST数据库,139个来自毛竹基因组CDS数据。(5)根据获得麻竹叶片新miRNA序列特征,设计高度特异的反转录茎环引物,对表达量较高的30种新miRNA进行了qRT-PCR检测。结果表明,所检测miRNA的溶解曲线均高度特异,表明其在麻竹叶片中是真实存在的,并非背景信号。采用qRT-PCR方法对这30种新miRNA在不同光照环境下的表达差异分析表明:在强光胁迫下(1200μmol/m2/s1), dla-miRC18、 dla-miRC27、 dla-miRC27-3p的表达明显上调,其中dla-miRC27-5p的上调幅度最大(达到对照的15倍),而dla-miRC1、dla-miRC19和dla-miRC28的表达明显下调(62%-76%);黑暗条件下,这些miRNA的表达变化相对较小,仅有dla-miRC1和dla-miR22的上调幅度比较明显(是对照的4倍左右),dla-miRC5、dla-miRC17和dla-miRC29的下调幅度达到50%-72%。由此表明,在麻竹的光信号转导、光胁迫反应等相关基因的表达中,这些miRNA可能发挥着重要调节作用。麻竹DlSCL6和DlAP2基因在模式植物拟南芥中的表达表明:这两个基因均对植物从营养生长向生殖生长的转换过程具有调控作用,为进一步深入研究竹子开花机理奠定了基础。对麻竹叶片miRNA的分离鉴定,获得了81条麻新的miRNA,并对部分新miRNA在不同光环境下的表达差异进行了研究,为进一步研究竹子miRNA功能奠定了基础。
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