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背景钙调蛋白依赖性蛋白激酶4(Calmodulin-dependent protein kinase Ⅳ,CaMKⅣ)是细胞内Ca2+下游信号分子之一,可干预Ca2+依赖性肌基因表达,影响骨骼肌再生、重塑并决定肌纤维异质性。此外,CaMKⅣ是调节外周免疫和炎症的关键分子,干预淋巴细胞激活、增殖和终末分化。我们的前期研究证实,急性肌损伤后,再生肌纤维能分泌多种免疫分子,并显著上调CaMKⅣ 水平。人为地持续上调体内CaMKⅣ将加重肌内炎症。生理条件下,骨骼肌组织内环境改变(如持续运动,高脂饮食等)可启动肌细胞内质网应激(Endoplasmic reticulum Stress,ER Stress)并激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。这种适应机制能帮助肌质网(内质网)恢复内稳态。病理性肌损伤(如特发性自身免疫性肌炎,IIMs)则可能诱发过度持续的ER Stress,导致肌细胞凋亡,并加重肌内炎症。持续促炎刺激能激活肌纤维ER Stress并诱发UPR反应,这提示肌纤维免疫分子表达与UPR的关联。研究表明,UPR参与免疫细胞的增殖、分化及功能表达,有助于免疫细胞促炎细胞因子的转录调控。那么,内源性的CaMKⅣ信号是否通过UPR影响肌纤维免疫特性呢?目前尚无相关的研究报道。本课题将探讨炎性环境中肌纤维ER Stress激活,以及CaMKⅣ信号对肌内ER Stress的干扰效应,明确CaMKⅣ-UPR通路影响肌纤维免疫特性的可能性。目的1.分析体外促炎环境中,内源CaMKⅣ基因的敲低是否会影响肌细胞的免疫特性。2.分析并明确CaMKⅣ-UPR途径影响肌纤维免疫特性的可能性。方法:1.C2C12细胞常规复苏培养,并对细胞进行CaMKⅣ shRNA慢病毒转染,RT-qPCR和Western Blot检测细胞的CaMKⅣ敲低效率。2.体外培养CaMKⅣ敲低/未敲低的C2C12细胞,马血清诱导分化,γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)致炎刺激。RT-qPCR、Western Blot和免疫荧光染色分析成肌细胞/分化肌纤维免疫分子表达。流式分析CaMKⅣ敲低/未敲低成肌细胞和分化肌管中CD40、CD86、和细胞间黏附分子-1(cell adhesion molecules,ICM)分子的表达改变情况。3.体外培养CaMKⅣ敲低/未敲低的C2C12细胞,马血清诱导分化,IFN-γ致炎刺激。添加毒胡萝卜素(Thapsigargin,Tg)或4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)以激动/阻断肌纤维内ER Stress;RT-qPCR、Western Blot和免疫荧光染色检测C2C12肌纤维UPR通路分子的激活及免疫分子的表达改变。结果1.CaMKⅣ shRNA转染后,C2C12细胞的CaMKⅣ基因及蛋白表达显著下调。敲低细胞体外增殖状态良好,马血清能诱导细胞分化融合,可用于后续实验。2.IFN-γ可诱导成肌细胞及分化肌管表达或上调主要组织相容性复合体-I(Major histocompatibility-I,MHC-I(H-2Kb)),MHC-Ⅱ(H2-Ea),Toll样受体家族-3(Toll-like receptors-3,TLR3),CD40,CD86,ICM-1,以及一些肌促炎因子(myokines)。CaMKⅣ基因敲低细胞内,上述炎症分子的水平显著下调。这表明,内源性CaMKⅣ基因参与上调肌细胞免疫分子的表达。3.IFN-γ促炎刺激可诱导分化肌管上调UPR通路中的真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eILF2α)和需肌醇酶 1a(inositol-requiring enzyme-1α,IRE1α)分子水平。但Tg诱导持续ER Stress时,肌纤维免疫分子的表达显著下调。CaMKⅣ基因敲低后,接受IFN-γ处理的C2C12肌纤维进一步上调UPR通路分子,但肌纤维免疫分子的表达水平较未敲低的细胞显著下调。这提示,CaMKⅣ信号可通过UPR反应调节肌细胞免疫分子表达。结论体外炎性环境中,内源性CaMKⅣ信号可能经由UPR反应调节肌纤维的免疫功能。