【研究背景及目的】肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤的病理性修复反应,以肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSC）活化、细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）过度沉积为主要特征。肝纤维化是病毒性、自身免疫性、酒精性、非酒精性脂肪性以及铜铁代谢异常等病因导致的慢性肝损伤发展为肝硬化的必经过程^[1,2],但这一过程是可逆的。因此,肝纤维化的治疗具有重要的意义。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类长约15-22个核苷酸的内源性非编码RNA,其主要通过结合靶向信使RNA（mRNA）的3′非编码区（3’-untranslated region3′UTR）,直接降解mRNA或抑制其转录来调节基因的表达^[3,4]。研究表明人体中约有1880种miRNAs^[5],且三分之一的mRNA受到miRNA的调控^[6][1],因此miRNA参与细胞的增殖、分化、凋亡、代谢及内分泌等多种功能的调节^[7-10][2]。MicroRNA的表达异常与肿瘤形成、心脏衰竭、神经再生等多种疾病相关^[11-13]。大量研究发现体内多种器官（心脏、肾脏、肺、肝脏）的纤维化伴随着miRNA的表达异常。在肝纤维化中,许多miRNA可通过影响HSC增殖活化、细胞外基质合成以及肝纤维化相关信号通路等多个环节调控肝纤维化的发生发展。因此,miRNA可能成为诊断和治疗肝纤维化的重要靶点。MicroRNA-134位于人14号染色体印记基因Dlk1/Dio3区域上hsa-miR-379^hsa-miR-656 miRNA簇,首先被发现为脑特异mi RNA^[14],能够参与突触细微结构的调控,并促进树突生长和脊髓形成^[15]。研究发现miR-134与神经系统肿瘤关系密切,能够通过诱导细胞周期阻滞、靶向干细胞相关基因Nanog等,参与调控肿瘤干细胞分化,抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭^[16]。本实验室前期研究证实,MicroRNA-134通过靶向调控KRAS抑制肝癌细胞增殖、克隆形成和转移等恶性生物学行为,且肝癌组织中mi R-134表达水平与肝癌临床恶性表型存在密切关联^[17]。晚近数据显示miR-134与特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）关系密切,相比健康人群,IPF患者miR-134表达显著下调^[18]。mi R-134在非小细胞肺癌（Non-small cell lung carcinoma,NSCLC）中可抑制TGF-β诱导的上皮细胞间质转型（Epithelial-to-mesenchymal transition EMT）过程^[19]。Liu Y等在肾细胞癌中也证实了miR-134可抑制肿瘤细胞的增殖及EMT过程^[20]。而Sangyoon Lee等近期研究发现miR-134介导昆布（Dieckol）的抗肝纤维化作用^[21]。以上研究表明miR-134参与了多种器官的纤维化进程,但miR-134在肝纤维化发生、发展中的作用及其机制尚不明确。基于以上研究,本课题拟研究miR-134在肝纤维化发生发展的作用及其机制,为肝纤维化的治疗提供新的思路。【实验方法】一、MicroRNA-134的表达情况与肝纤维化的关系1.从中国科学院上海动物中心购买Sprague–Dawley（SD）大鼠8只,重约180-200g,随机分为两组:对照组和模型组,每组各4只。对照组按照每公斤体重一毫升生理盐水给予腹腔注射,每周2次,共8周;模型组按照每公斤体重一毫升50%CCl₄/橄榄油混合液腹腔注射,每周2次,共8周,构建大鼠肝纤维化模型。于第8周末麻醉、处死所有大鼠。肝组织石蜡包埋、切片后用苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin,H&E）、天狼星红-饱和苦味酸染色（Sirius red）进行组织化学染色评价肝纤维化程度,并用相关软件Image-Pro Plus进行纤维化半定量分析。Real time RT-PCR检测miR-134及肝纤维化相关基因α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、Ι型胶原蛋白（Collagen typeΙ,COLΙ）的mRNA表达水平。Western blot检测肝纤维化相关基因α-SMA、COLΙ的蛋白表达水平。2.HSC活化过程中miR-134表达变化利用不同浓度TGF-β（0 ng/ml、2 ng/ml、4 ng/ml）处理人HSC-LX2 24h后,利用Real time RT-PCR技术检测miR-134及α-SMA、COLΙ的表达水平。二、MicroRNA-134对HSC的增殖及活化的影响1.MicroRNA-134对HSC增殖能力影响接种HSC-LX2至96孔板,每孔3000个细胞,24h后转染对照NC和miR-134模拟物（mimic）上调人HSC-LX2中miR-134表达。通过CCK8方法检测上调miR-134对HSC增殖能力影响。接种HSC-LX2至96孔板,每孔3000个细胞,24h后转染对照和miR-134抑制剂（inhibitor）下调人HSC-LX2中miR-134表达。通过CCK8方法检测下调miR-134对HSC增殖能力影响。2.MicroRNA-134对HSC活化的影响转染miR-134 mimic上调HSC-LX2中miR-134或转染miR-134 inhibitor下调mi R-134后,分别收集RNA和蛋白,分别利用Real time RT-PCR和western blot检测HSC-LX2α-SMA、COLΙ在mRNA和蛋白水平表达变化情况。三、MicroRNA-134抑制HSC增殖及活化的机制研究1.利用电脑软件target Scan预测miR-134的靶基因,查阅文献,选择与肝纤维化相关的靶基因-转化生长因子激酶1（transforming growth factor-beta-actived kinase1,TAK1）结合蛋白1（TAK1 binding protein 1,TAB1）进行验证。2.转染miR-134 mimic上调HSC-LX2中miR-134的表达或转染miR-134 inhibitor下调miR-134表达,通过Real time RT-PCR和western blot检测预测靶基因TAB1mRNA和蛋白水平变化。3.根据软件预测的miR-134与TAB1 3′UTR的结合位点构建荧光素酶报告基因质粒,检测miR-134对该萤光素酶报告基因作用。将miR-134在TAB1 3′UTR上的结合位点突变后,检测mi R-134对突变后的荧光酶报告基因的作用,以明确TAB1是否为miR-134的直接靶基因。4.明确TAB1是否介导miR-134对HSC的作用利用化学合成的TAB1 siRNA下调HSC-LX2中TAB1的表达后,通过CCK8方法检测HSC增殖能力变化。通过Real time RT-PCR和western blot检测α-SMA、COLΙ的表达变化,共转染miR-134 inhibitor和TAB1 siRNA后,通过CCK8方法HSC增殖能力变化和western blot检测α-SMA、COLΙ的表达变化,证实TAB1是否介导mi R-134对HSC的抑制作用。四、上调miR-134对实验性大鼠肝纤维化的影响雄性SD大鼠24只,重180-200 g,将大鼠随机分为2组:对照组（12只）按5×10⁹ pfu/只尾静脉注射AdGFP病毒,2次/周;AdmiR-134治疗组（12只）按5×10⁹pfu/只尾静脉注射Ad-134病毒,2次/周,共7周。注射病毒1周后,两组均给予50%CCl₄/橄榄油1ml/Kg体重腹腔注射,2次/周,共6周,于第6周末处死所有大鼠。进行肝组织H&E、Sirius red化学染色评价肝纤维化程度,利用Real time RT-PCR检测miR-134及α-SMA、COLΙ的表达变化。五、统计学处理采用SPSS 17.0统计软件包进行相关数据分析,方差齐性两样本资料采用两样本双尾T检验方法进行分析;P<0.05为差异有统计学差异,P<0.01为具有非常显著性差异。【实验结果】一、Micro RNA-134表达下调与肝纤维化的进展相关1.H&E染色发现,相比正常组,模型组肝组织中肝小叶结构破坏、脂肪变性明显,大量纤维间隔形成。天狼星红-饱和苦味酸染色显示造模后肝组织大量纤维疤痕形成。Real time RT-PCR和Western blot检测发现,与正常对照相比,纤维化相关基因α-SMA、COLΙmRNA及蛋白表达均上调。上述结果提示:CCl₄诱导的肝纤维化模型构建成功,且肝纤维化后肝组织中mi R-134表达水平较正常肝脏明显下调。2.HSC活化过程中miR-134表达下调用TGF-β活化HSC-LX2细胞后,Real time RT-PCR检测发现α-SMA、COLΙ表达显著上调,miR-134表达则显著下调。二、MicroRNA-134抑制HSC的增殖及活化1.MicroRNA-134抑制HSC增殖转染miR-134 mimic上调HSC-LX2细胞中mi R-134的表达后,通过CCK8检测发现miR-134可显著抑制HSC增殖能力。转染miR-134 inhibitor下调HSC-LX2细胞中miR-134的表达后,通过CCK8检测发现下调miR-134可促进HSC增殖能力。2.MicroRNA-134抑制HSC的活化转染miR-134 mimic上调HSC-LX2中miR-134的表达后,α-SMA、COLΙ在mRNA和蛋白水平均明显下降,而转染miR-134 inhibitor下调HSC-LX2中miR-134的表达后,α-SMA、COLΙ表达均升高。三、TAB1是miRNA-134的直接靶基因1.Target Scan软件预测结果显示TAB1 3′UTR上含有mi R-134的作用位点。上调HSC-LX2细胞中miR-134表达后,TAB1 mRNA和蛋白表达显著降低;下调HSC-LX2细胞中miR-134表达后,TAB1 mRNA和蛋白表达显著升高。2.上调mi R-134表达可显著抑制TAB1 3′UTR荧光素酶报告基因活性。将TAB1 3′UTR上的miR-134结合位点突变后,miR-134对此报告基因的活性无明显影响,表明TAB1为mi R-134的直接靶基因。3.下调HSC-LX2细胞中TAB1表达可显著抑制HSC的增殖和活化,与miR-134 mimic效应相似,转染miR-134 inhibitor下调miR-134后促进HSC-LX2细胞增殖及活化,而共转染miR-134 inhibitor和TAB1siRNA后,此促进作用减弱,表明TAB1可能部分介导miR-134对HSC细胞增殖及活化的抑制作用。四、上调miRNA-134抑制实验性大鼠肝纤维化进程H&E染色发现,相比AdGFP组,AdmiR-134治疗组肝组织中肝小叶结构基本正常、脂肪变性较少。天狼星红-饱和苦味酸染色显示AdmiR-134治疗组肝胶原沉积明显减少;Real time RT-PCR检测发现Admi R-134治疗组α-SMA、COLΙmRNA及表达下调。上述结果提示:上调miR-134抑制实验性大鼠肝纤维化进程【结论】1.MicroRNA-134表达下调与肝纤维化的进展相关;2.MicroRNA-134可抑制HSC的增殖及活化;3.MicroRNA-134通过调控其直接靶基因TAB1的表达抑制HSC增殖及活化;4.上调miRNA-134抑制实验性大鼠肝纤维化进程。